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伪狂犬病毒（PRV）感染给养猪业造成巨大的经济损失,因此开展抗病育种研究从遗传本质上提高猪对PRV的抗性,是减少伪狂犬病发生的重要手段。本实验室前期工作中构建了PRV感染PK15细胞后的蛋白质组表达谱,发现多种内质网应激反应蛋白在PRV感染过程中均显著上调表达。本研究在前期蛋白质组学研究的基础上首先探究PRV激活内质网应激反应通路的途径以及内质网应激反应对PRV增殖的影响,然后利用生物信息学方法筛选并验证靶向猪内质网应激反应通路关键基因的宿主miRNAs,最后分析miRNAs对PRV增殖的影响。本研究主要取得以下结果:1.猪伪狂犬病毒感染激活内质网应激反应通路PRV感染PK15细胞后不同时间点收集细胞,qRT-PCR和Western blot检测葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的表达。结果显示,内质网应激标志分子GRP78在PRV感染早期显著上调表达,表明内质网应激反应被激活。通过qRT-PCR和Western blot进一步鉴定PRV感染激活未折叠蛋白反应（UPR）的具体途径,结果显示,PRV感染后激活IRE1-XBP1和e IF2α-ATF4信号通路。此外,通过qRT-PCR检测PRV感染过程中转录因子ATF4、促凋亡因子CHOP和抗凋亡因子Bcl-2的表达情况。结果显示,PRV感染显著上调了ATF4和CHOP基因的m RNA表达,而在感染晚期下调Bcl-2的表达,表明PRV通过CHOP-Bcl-2通路在感染晚期诱导细胞凋亡。2.内质网应激反应对伪狂犬病毒增殖的调控作用利用PcDNA3.1-GRP78重组载体过表达GRP78以及RNAi技术敲低GRP78后再感染PRV,绝对定量PCR和TCID50检测PRV基因组拷贝数和病毒滴度,结果显示,过表达GRP78显著增加PRV基因组拷贝数和病毒滴度,而敲低GRP78后对PRV增殖没有显著影响。用不同浓度的内质网应激诱导剂Tg和内质网应激阻断剂TUDCA处理PK15细胞后再感染PRV,Western blot、绝对定量PCR和TCID50结果显示,Tg处理后上调GRP78表达,并显著促进PRV增殖,而TUDCA处理后显著抑制PRV增殖。同时通过CCK-8检测发现不同浓度Tg、TUDCA处理后不影响细胞活性。3.鉴定靶向猪内质网应激反应关键基因的miRNAs通过Target Scan生物信息学软件预测靶向内质网应激反应关键基因ATF6、PERK、GRP78、IRE1和XBP1的miRNAs,Target Scan预测结果显示,靶向ATF6、PERK、GRP78、IRE1和XBP1的交集miRNAs为miR-142-5p、miR-145-5p、miR-150和miR-199a-5p,并将这些miRNAs作为候选miRNAs。构建含有候选miRNAs结合位点的双荧光素酶报告载体,并与miRNA模拟物共转染幼仓鼠肾（BHK-21）细胞。双荧光素酶报告系统结果显示,过表达miR-142-5p后显著抑制ATF6、IRE1和XBP1重组载体荧光素酶活性,过表达miR-199a-5p后显著抑制IRE1和XBP1重组载体荧光素酶活性,以及过表达miR-145-5p后显著抑制IRE1、PERK重组载体荧光素酶活性,表明miR-142-5p、miR-145-5p和miR-199a-5p可能靶向内质网应激反应关键基因。转染miRNA模拟物后,通过qRT-PCR检测miR-142-5p、miR-145-5p、miR-199a-5p及其靶基因ATF6、IRE1、XBP1和PERK的m RNA表达水平。结果显示,与阴性对照组相比,转染miRNA模拟物后miR-142-5p、miR-145-5p和miR-199a-5p表达水平显著上调。与此同时,过表达miR-142-5p后,显著抑制ATF6基因m RNA的表达。利用Western blot检测发现在转染miR-142-5p mimics的细胞中ATF6蛋白表达显著受到抑制,表明miR-142-5p与ATF6基因m RNA靶位点结合后,抑制ATF6蛋白的表达。4.miRNAs对伪狂犬病毒增殖的影响利用PRV感染PK15细胞后提取细胞总RNA进行miRNA测序,筛选到35条miRNAs差异表达,其中包括miR-142-5p和miR-199a-5p,表明PRV感染PK15细胞后宿主细胞miRNAs表达发生变化,miRNAs可能通过靶向宿主基因从而调节内质网应激反应进而调控病毒的增殖。在PK15细胞中转染miR-142-5p、miR-145-5p、miR-199a-5p模拟物48 h后感染PRV,利用绝对定量PCR和TCID50检测PRV基因组拷贝数和病毒滴度,结果显示,过表达miR-142-5p、miR-145-5p和miR-199a-5p后,PRV的增殖没有显著变化。综上所述,本研究首次发现PRV感染诱导内质网应激反应并激活UPR的IRE1-XBP1和e IF2α-ATF4通路,并从miRNA影响内质网应激反应关键基因表达的角度,探究miRNA靶向内质网应激调控PRV增殖的作用机制。本研究为猪抗病候选基因的挖掘提供了新的思路。