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腈水合酶(EC 4.2.1.84)可催化2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈(CPIN)水合生成相应的酰胺,用于合成高效杀虫剂氰戊菊酯的重要前体戊菊酸。但目前报道的可转化CPIN的腈水合酶数量较少且活性较低,极大地限制了催化效率。因此,对腈水合酶的重组表达及分子改造进行研究,改善其催化活性具有重要意义。本文以实验室前期获得的对CPIN有高活性的腈水合酶NHaseK为研究对象,构建了其在大肠杆菌中的功能表达体系。利用pETDuet-1具有双T7启动子的优势,将NHaseK功能表达必须具备的α亚基、β亚基和活化元件17k以八种不同的组合方式插入于两个启动子之下。当将三段基因以基因簇形式共同插入于第一个启动子之下时,亚基表达量均衡、活化元件充分表达,酶活表现最佳,比活为0.78 U/mg蛋白。进一步考察发现,不同质粒及SD序列对大肠杆菌表达NHaseK的影响不明显。考虑到p RSFDuet-1的卡那霉素抗性更适于发酵,确定以此为载体重组表达NHase K,粗酶活力为222.6 U/L。其次,采用同源建模和分子对接构建NHaseK-CPIN复合物构象,以此为基础改造NHaseK。一方面,通过虚拟丙氨酸扫描筛选出10个突变热点,根据它们的虚拟饱和突变结果选择αG119进行饱和突变实验,但效果不佳；根据它们的丙氨酸突变实验结果选择βD49和αQ88进行饱和突变,获得14株正向突变子,其中βD49G活性最高,其比活为2.48 U/mg蛋白,是原始酶NHaseK的3.2倍。另一方面,选择预测通道附近的大位阻残基βF41进行饱和突变,未能获得正向突变子。进一步对正向突变子进行组合突变,未能获得理想突变子。最后,考察βD49G及NHaseK的酶学性质并初步探索催化CPIN工艺。发现βD49G的Kat增大4.4倍,是其活性提升的主要原因。此外p49G热稳定性也都有所提升,其在35℃、40℃、45℃的半衰期分别为114h、76 h、25 h,较原始酶NHaseK分别延长39%、72%、56%。初步探索重组菌E.coli/pRSFDuet-βD49G及E.coli/pRSFDuet-NHaseK催化工艺,确定它们的最适转化条件均为40℃、pH6.5的Na2HPO4-柠檬酸缓冲体系、5%(v/v)甲醇作助溶剂。当βD49G以0759 gDCW/L的细胞用量催化0.5 g/L CPIN时,在1h内完成转化,其效率是NHaseK的2倍。