副结核病(Paratuberculosis)是由禽分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis, Map)引起的牛、羊、羊驼等动物的慢性传染性肠炎。本病广泛流行于世界各国,每年造成巨大经济损失。OIE将其列为B类疫病。目前该病尚无良好的治疗方法和预防措施,控制该病的主要途径就是检出、隔离、捕杀。因此建立灵敏、快速的检测方法非常重要。据报道IS900基因是副结核分枝杆菌的特异性基因,本课题组以IS900基因为基础,对牛和羊驼副结核病间接ELISA检测方法的建立和应用进行了一系列的研究。1.副结核分枝杆菌IS900基因原核表达及其产物的抗原性分析以副结核分枝杆菌K-10菌株DNA为模板,PCR扩增出IS900基因,将其克隆至pGEM-T载体,目的基因经PCR酶切鉴定后连接至原核表达载体pET-32a(+),获得的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白在IPTG诱导后以包涵体形式高效表达,Western blot分析及免疫鼠血清ELISA抗体检测结果表明重组蛋白具有良好的免疫原性。2.牛副结核病间接ELISA检测方法的建立和应用将表达重组蛋白pET-32a-IS900用作包被抗原,建立了针对牛Map血清抗体的间接ELISA检测方法。并且确定了最适抗原包被浓度为4.4μg/mL,最佳封闭条件为2%的明胶4℃封闭24h,最适血清稀释度为1：100,酶标抗体最适稀释度为1：10000,底物于37℃孵育15mmin效果最佳,该ELISA阳性判定标准为○D490nm≥0.52。应用该间接ELISA方法检测了实验室保存的牛血清,结果表明该方法可以对Map进行检测。3.羊驼副结核病间接ELISA检测方法的建立和应用以重组蛋白作为包被抗原,建立了羊驼副结核病间接ELISA检测方法,确定最适抗原包被浓度为3.75μg/mL、最佳封闭条件为2%的明胶4℃封闭24h、最适血清稀释度为1：50、酶标抗体最适稀释度为1：5000,底物最适条件为37℃孵育15min,该ELISA阳性判定标准为○D490nm≥0.62,应用该间接ELISA方法检测了实验室保存的羊驼血清,结果表明该诊断方法具有良好的特异性及敏感性,显示了良好的应用前景。