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目的：采用成骨细胞及破骨细胞培养体系，探索结核杆菌热休克蛋白10（Mtcpn10）是否通过参与成骨细胞增殖和破骨细胞生成，从而影响骨关节结核患者局部骨代谢平衡的分子机制，为骨结核骨质破坏基因治疗寻找新的治疗靶点。方法：1）建立体外人成骨细胞及破骨细胞培养体系：使用髂骨块体外培养获取成骨细胞，通过显微镜下细胞形态出现钙结节及碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性测定对其鉴定。破骨细胞通过外周静脉血单个核细胞，用含RANKL和M-CSF的α-MEM培养液重悬后接种在含有骨膜片和盖玻片孔板上，培养21d后获得获得破骨细胞，通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色和瑞氏-吉姆萨染色进行细胞形态鉴定，通过甲苯胺兰染色及电镜观察鉴定骨陷窝的形成；2）以10μg/mL、1μg/mL及0.1μg/mL不同浓度的r-Mtcpn10作用于上述体外培养的成骨细胞，观察成骨细胞的增殖、细胞周期、碱性磷酸酶活性及钙结节形成情况。应用Realtime-PCR方法检测成骨细胞OPGmRNA及RANKL mRNA，并用Western-blot免疫印迹法检测OPG及RANKL蛋白表达情况；3）以1μg/mL、0.1μg/mL及0.01μg/mL不同浓度r-Mtcpn10诱导实验组破骨细胞的形成，比较各组TRAP阳性多核细胞形态及数目、骨陷窝数量和面积、上清液中钙离子浓度，ELISA检测上清液中肿瘤坏死因子TNF-α浓度，应用Realtime-PCR方法检测破骨细胞NFATc1mRNA、c-Fos mRNA，Western-blot免疫印迹法分别检测其蛋白表达；4）建立人成骨细胞-外周血单核细胞共培养体系，用1μg/mL r-Mtcpn10作用于共培养体系，培养18d后观察破骨细胞大小和数量、骨陷窝数量和面积、上清液中钙离子浓度，应用Realtime-PCR方法检测NFATc1mRNA、ｃ-Fos mRNA、RANKL mRNA及OPG mRNA。结果：1）体外人成骨细胞及破骨细胞培养体系成功建立：成骨细胞培养25d后融合形成不透光矿化结节并染色阳性，第8d碱性磷酸酶染色呈蓝色沉淀，第10d碱性磷酸酶活性达到峰值随后下降；培养外周血单核细胞于第21d形成TRAP（+）破骨细胞，出现骨陷窝并释放钙离子。2）r-Mtcpn10对体外培养的成骨细胞增殖的影响：MTT实验检测比较各浓度实验组与对照组的成骨细胞增殖能力，结果显示r-Mtcpn10与成骨细胞的增殖活性间存在浓度-活性及时间-活性依赖关系，高浓度r-Mtcpn10及长时间的作用均能抑制成骨细胞的增殖活性；流式细胞仪检测细胞周期结果显示，与对照组比较，经r-Mtcpn10处理的各浓度实验组G1期、G2期细胞数量明显增多，S期细胞数量明显减少，实验组G1期增长了8.12%（24h，P＜0.05）、22.77%（48h，P＜0.05），G2期增长了5.58%（24h，P＜0.05）、194%（48h，P＜0.05），S期减少了71.6%（24h，P＜0.05）、89.01%（48h，P＜0.05），PI减少了29.8%（24h，P＜0.05）、44.92%（48h，P＜0.05）；碱性磷酸酶活性测定结果显示，10μg/mL组降低6.33±1.67（7d，P<0.05）、6.97±1.40（10d，P<0.05），1μg/mL组降低4.95±1.57(7d，P<0.05）、5.68±1.23（10d，P<0.05）；高浓度r-Mtcpn10组（10μg/mL）钙结节形成的数量、面积、颜色均较对照组明显减少；Realtime-PCR实验结果显示，r-Mtcpn10浓度与OPG mRNA的表达相关，其中，10μg/mL组降低41.6%（48h，P＜0.05）、52.6%（72h，P＜0.05），1μg/mL组降低45.9%（48h，P＜0.05）、48.3%（72h，P＜0.05），0.1μg/mL组降低9.3%（48h，P＞0.05）、26.7%（72h，P＜0.05）；r-Mtcpn10浓度-时间依赖性增加了RANKL mRNA，10μg/mL组增加98.2%（48h，P＜0.05）、124%（72h，P＜0.05），1μg/mL组增加85.7%（48h，P＜0.05）、67.3%（72h，P＜0.05），0.1μg/mL组增加45.4%（72h，P＜0.05）；10μg/mL组RANKL蛋白随时间有相应的增加，而OPG蛋白表达降低。3）TNF-α浓度ELISA实验显示，不同浓度r-Mtcpn10作用于外周血单核细胞，各实验组与对照组TNF-α浓度差别无统计学意义（F=2.098，P＞0.05）；r-Mtcpn10对破骨细胞的形成的影响：形态学观察结果显示，除M-CSF实验组外，其他各实验组均见TRAP（+）破骨细胞和骨陷窝形成；与对照组比较，RANKL+r-Mtcpn10组和r-Mtcpn10组在破骨细胞数量（P＜0.05）、骨陷窝数量（P＜0.05）、骨陷窝面积（P＜0.05）、上清液钙离子浓度（P＜0.05）均明显增加；两组r-Mtcpn10为1μg/mL时破骨细胞细胞数量有统计学意义（P＜0.05），各组骨陷窝数量无统计学意义（P＞0.05）、骨陷窝面积有统计学意义（P＜0.05）；r-Mtcpn10浓度-时间依赖性增加NFATc1mRNA表达，各浓度组与对照组比较均有统计学意义（P＜0.05），与RANKL组比较，1μg/mL组表达无差异（P＞0.05）、0.1μg/mL组和0.01μg/mL组表达有差异（P＜0.05）；r-Mtcpn10增加c-Fos mRNA表达，与对照组比较，1μg/mL组表达增加了19倍（2h，P＜0.05）、0.1μg/mL组表达增加了7倍（2h，P＜0.05），各浓度组与RANKL组比较均有统计学意义（P＜0.05）；1μg/mL组NFATc1蛋白表达随时间而增加，c-Fos蛋白却降低。4）1μg/mL r-Mtcpn10对人成骨细胞-外周血单核细胞共培养体系的影响：r-Mtcpn10组和对照组均有TRAP（+）破骨细胞和骨陷窝生成，1μg/mL r-Mtcpn10组破骨细胞细胞数量、骨陷窝数量、骨陷窝面积及钙离子浓度与对照组比较，差别均有统计学意义（P＜0.05）；r-Mtcpn10组NFATc1mRNA、c-Fos mRNA、RANKL mRNA、OPG mRNA表达量分别为3.878±0.5748、0.4192±0.1030、2.832±0.3075、1.135±0.0457，除了c-Fos mRNA，与对照组比较均低于r-Mtcpn10组有统计学意义（P＜0.05）。结论：1）重组结核杆菌热休克蛋白10（r-Mtcpn10）可能通过阻滞细胞周期，抑制成骨细胞增殖，并通过降低碱性磷酸酶活性，促进成骨细胞RANKL mRNA表达，抑制OPG mRNA表达，因此降低OPG mRNA/RANKL mRNA比值抑制了成骨细胞的成骨能力；2）r-Mtcpn10可能通过上调NFATc1mRNA、c-Fos mRNA表达，激活NF-κB通道，促进破骨细胞的生成；3）在成骨细胞和单核细胞共培养体系中，r-Mtcpn10促进成骨细胞RANKL表达后，可能促进破骨前体细胞NFATc1和c-Fos表达，增加破骨细胞形成，为骨结核靶向基因治疗提供新的治疗靶点。