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纤维质是地球上存量最丰富的可再生资源,通过生物、物理或化学等方法处理,将其降解为单糖,进而发酵生产醇、有机酸等大宗工业品,是替代不可再生型化石能源和原材料的解决方案。采用纤维素酶降解纤维素的生物处理方案与物理和化学方法相比,具有绿色、环境友好等优势,其中高活性纤维素酶的获取是关键环节。酶的定向进化是获得高活性酶的有效方法。然而,天然木质纤维素都是高度结晶、无定型构成的异质性材料,为纤维素酶的定向进化带来了挑战。为此,设计构建了细胞表面展示释放系统,即以冰核蛋白INP作为转运蛋白,以蛋白内含子的N-端作为剪切靶点,形成了冰核蛋白-蛋白内含子-目标蛋白这样的三明治结构。该系统适用于以不溶性底物无定型纤维素(RAC)作为底物来进行纤维素酶的定向进化。本文我们将来源于Clostridium phytofermentans的内切纤维素酶Cp Cel5A构建到表面展示释放系统中。应用易错PCR技术产生随机突变体文库,再通过延长的重叠延伸聚合酶链式反应POE-PCR法构建到表面展示载体系统中,将该突变系统转入表达宿主菌大肠杆菌BL21中。建立了刚果红平板检测筛选系统,从3000个突变体中筛选得到十余个突变体。通过酶活性分析,最终获得两株突变体3A11和5D4。其氨基酸突变位点分别为A139T和A184T。与野生型相比,3A11对不溶性底物RAC的比活力提高了1.3倍,可溶性底物CMC提高1.1倍。而5D4的酶活力对RAC和CMC降低了1.3倍和1.0倍。突变体3A11的最适p H值与野生型没有明显差异,均在5.0左右。通过对两株突变体3A11和5D4的时间进程测定及蛋白质结构预测,初步探讨了突变对活力的影响机制。本研究利用细胞表面展示释放系统成功筛选到了纤维素酶活力提高的突变体。证明此方法可以用于纤维素酶的定向进化。此外,该表达系统在其它工业酶的定向进化、酶的固定化等方面也具有极大的应用潜力。