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嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）是常见的酸奶发酵剂,也是唯一广泛用于食品发酵的链球菌,它与德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）作为发酵剂一起生产酸奶已有数千年历史。此外,嗜热链球菌也被认为是一种益生菌,进入人体肠道后可降低病理风险并发挥有益作用。因此,嗜热链球菌是生产异源蛋白质的良好候选者,也是一个很有前途的细胞工厂。食品级载体在异源蛋白表达方面具有优势。然而,嗜热链球菌的食品级载体目前仍然相对较少。因此,需要开发新的食品级表达载体。乳糖是嗜热链球菌生长的主要碳源。乳糖运输、代谢和潜在的调控机制已在嗜热链球菌中得到广泛研究。首先,乳糖通过乳糖渗透酶转运到细胞质中,然后再被胞内的β-半乳糖苷酶水解成葡萄糖和半乳糖。葡萄糖通过糖酵解途径转化为丙酮酸,再通过乳酸脱氢酶转化为乳酸。而半乳糖通常被嗜热链球菌弱代谢,被乳糖渗透酶逆向释放到培养基中。因此,乳糖渗透酶和β-半乳糖苷酶对该菌株的乳糖代谢和生长至关重要。本研究基于嗜热链球菌的乳糖代谢,尝试构建新型的食品级表达载体,主要体现在以下几个方面:（1）嗜热链球菌中β-半乳糖苷酶的α-互补现象。首先构建嗜热链球菌β-半乳糖苷酶N端7-36氨基酸残基缺失的突变体S.thermophilusΔα。S.thermophilusΔα丧失了利用乳糖的能力和β-半乳糖苷酶活性。随后,构建了一系列表达不同长度α-肽的载体,分别为1-36（Sα1）、1-53（Sα2）和1-88（Sα3）氨基酸残基,并转化至S.thermophilusΔα。通过测定重组菌株的生长和β-半乳糖苷酶活性,发现表达Sα2和Sα3的重组嗜热链球菌恢复了在乳糖培养基中的生长能力,其β-半乳糖苷酶活性分别达到野生菌株的24.50%和11.50%。为了测定回补菌株在天然环境下的生长能力,将重组嗜热链球菌接种到巴氏杀菌乳中,随后与保加利亚乳杆菌进一步共培养。结果表明,重组嗜热链球可以利用牛乳生长并产酸。这些结果表明嗜热链球菌中存在β-半乳糖苷酶的α-互补系统。（2）嗜热链球菌中基于α-互补的食品级表达载体的构建。构建食品级载体p SEα,p SEα去除了抗生素的抗性基因,并以嗜热链球菌的Sα2作为选择标记。此外,食品级载体还包含来自大肠杆菌（Escherichia coli）β-半乳糖苷酶的α-肽,这有利于在E.coli DH5α中构建和筛选重组质粒,从而提高嗜热链球菌的转化效率。由于嗜热链球菌和大肠杆菌中都存在β-半乳糖苷酶的α-互补现象,因此探讨了它们的相互作用。结果表明,α-肽只能补充它们自身的β-半乳糖苷酶的缺失,嗜热链球菌和大肠杆菌的两个α-互补系统之间没有相互作用。为了测试食品级载体的表达能力,构建了表达绿色荧光蛋白的载体p SEα-Pldh-gfp,结果显示该载体可在嗜热链球菌中高度表达绿色荧光蛋白,最大荧光值达到120000±14900 RFU。因此,p SEα是一种有效且安全的嗜热链球菌载体,具有潜在的应用价值。（3）利用食品级表达载体p SEα表达谷氨酸脱羧酶。通过生物信息学方法,确定了来自青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）的谷氨酸脱羧酶基因gad B。先将谷氨酸脱羧酶在大肠杆菌中过表达并分析其酶学性质,再克隆至食品级表达载体中表达。首先构建表达B.adolescentis B3谷氨酸脱羧酶的载体p ET28b-gad B,并转化至E.coli BL21中过表达。经SDS-PAGE分析,确定了酶的大小为53 k Da。其酶学性质的测定表明,该酶的最适反应温度为30℃,最适p H为6.0,然而温度和p H稳定性较差。随后,构建了表达谷氨酸脱羧酶的食品级载体p SEα-Pldh-gad B。重组菌株S.thermophilusΔα/p SEα-Pldh-gad B的谷氨酸脱羧酶活性达到16.35±0.80U/m L,是S.thermophilusΔα/p SEα酶活性的5.88倍。这些结果表明,载体p SEα可在嗜热链球菌中表达谷氨酸脱羧酶,为食品级表达载体的应用奠定了基础。在未来可以作为提高乳制品性能和开发功能性酸奶的潜在工具。（4）嗜热链球菌中乳糖/半乳糖渗透酶作为筛选标记的初步探究。构建了嗜热链球菌乳糖渗透酶缺失的突变体S.thermophilusΔlac S。S.thermophilusΔlac S丧失了利用乳糖和半乳糖的能力。随后,构建了表达嗜热链球菌完整乳糖渗透酶和其N端1-486氨基酸残基以及表达大肠杆菌乳糖渗透酶和半乳糖转运酶的回补载体,并转化至S.thermophilusΔlac S。通过测定回补菌株的生长,发现表达嗜热链球菌完整乳糖渗透酶的菌株在乳糖和半乳糖培养基中均恢复了生长能力;表达嗜热链球菌乳糖渗透酶N端的菌株仅在乳糖培养基中恢复了生长能力;表达大肠杆菌乳糖渗透酶的回补载体转化嗜热链球菌一直未成功;而表达大肠杆菌半乳糖转运酶的菌株仅在半乳糖培养基中恢复了生长能力。这些结果为构建以乳糖/半乳糖渗透酶作为食品级筛选标记的表达载体奠定了理论基础,可进一步拓宽嗜热链球菌的研究工具箱。