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猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrom Virus,PRRSV)主要引起怀孕母猪流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍和仔猪呼吸困难、高死亡率,具有传播快、流行范围广、高度传染性等特点,特别是"高致病性猪蓝耳病"几乎蔓延全国各地,造成养猪业严重经济损失。由于本病同其他引起猪繁殖障碍的疾病表现出极为相似的临床症状,并由于新流行毒株的基因发生了突变,毒力增强,特别是猪群出现了 PRRSV与其他病原如猪圆环病毒、猪瘟病毒等的混合感染,表现为症状、病变的非典型化和复杂化,给猪群的临床诊断和防疫带来新的难度。为了有效控制PRRS,我国猪群大量使用PRRSV疫苗。由于PRRSV灭活疫苗在临床使用的防疫效果不稳定,目前多用PRRSV弱毒疫苗,而大部分猪群接种PRRSV弱毒疫苗以后,将出现一定时期的病毒血症,猪体长期带毒,甚至排毒,猪群一旦感染自然界的野毒,将很难进行鉴别,不利于PRRSV的临床诊断和控制。因此,有必要建立一套能够区分PRRSV自然感染与疫苗免疫的快速鉴别诊断技术。RT-PCR方法是一种可以快速检测血液、精液以及组织样品中病毒核酸的生物技术。利用特异性引物进行RT-PCR还可以区分不同基因型的病毒株。PRRSV的ORF5基因和编码非结构蛋白2(Nsp2)的Nsp2基因是基因组高度变异的区域,而且目前发现的PRRSV基因缺失主要集Nsp2基因中,GP5和Nsp2蛋白的变异会导致病毒毒力和致病性的差异。本论文开展了两方面的工作,一是建立了常规RT-PCR方法,二是用本文建立的常规RT-PCR方法检测了 2011-2014年的部分送检样品。结果如下:1常规RT-PCR方法的建立本研究根据PRRSV基因编码区中变异最大的GP5和非编码区中变异最大的Nsp2两个目的片段,设计了 2对GP5引物(P1和P2)和5对Nsp2引物(N1和N5),克隆了 GP5和Nsp2基因,从中各筛选优化出一套效果最好的引物(P2和N3)构建了两套常规RT-PCR,并进行了特异性和灵敏度实验。结果表明,本文建立的常规RT-PCR仅能扩增出PRRSV毒株,不扩增猪瘟病毒、猪细小病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、猪圆环病毒2型和猪流感病毒等毒株。扩增GP5双链DNA的灵敏度为700拷贝,扩增GP5基因组的灵敏度为稀释106倍;扩增Nsp2双链DNA的灵敏度为80拷贝,扩增Nsp2基因组的灵敏度为稀释107倍。结果表明,本文建立的常规RT-PCR具有良好的特异性和较高的灵敏度,可用于临床检测。2常规RT-PCR方法的临床应用采用本文建立的常规RT-PCR方法,对2011-2014年送检的329批血样、组织病料等进行了检测。首先,对检测阳性样品测序后建立了 PRRSV序列库,用DNAstar同源性分析软件对P2引物扩增得到的全部序列及送检单位使用的疫苗序列进行对比分析,并对4家猪场近4年的阳性序列分别进行同源性分析,结果发现用本文所构建的常规RT-PCR方法能明显区分野毒株与疫苗株;而且用N3引物扩增得到的序列进行分析,不仅能区分野毒株与疫苗株,还能进一步区分毒株为经典型还是高致病型。综上所述,本文建立的两套常规RT-PCR方法能较好地鉴别PRRSV的自然感染与疫苗免疫,可用于PRRSV临床诊断和防控。