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目的体外培养多发性骨髓瘤骨病(Myeloma bone disease,MBD)患者骨髓来源成骨细胞,鉴定其生物学性状,并与健康志愿者骨髓来源的成骨细胞比较其数量及成骨潜能差异。初步探讨CCL3对MBD患者成骨细胞数量及功能的影响及可能机制。方法第一部分：选择新确诊的多发性骨髓瘤骨病患者10例,健康志愿者8名作为研究对象。采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞(BMMNC),应用地塞米松、β-甘油磷酸钠及维生素C诱导并纯化获得多发性骨髓瘤骨病患者成骨细胞(osteoblast,OB),以碱性磷酸酶(ALP)染色及Von Kossa’s钙染色鉴定成骨细胞,流式细胞术(FCM)测定培养获得的成骨细胞表面CD138-CD45-CD34-表达以测定其纯度。比较MBD患者及健康志愿者成骨细胞生物学特征及成骨潜能差异。采用FCM分别检测MBD患者及健康志愿者成骨细胞膜CCRl的表达水平。第二部分：选择21例新确诊的MBD患者作为研究对象,骨髓培养法体外培养其骨髓来源的成骨细胞,以碱性磷酸酶染色及Von Kossa’s钙染色鉴定成骨。将传代获得的第三代成骨细胞以相同密度接种后分为三组进行干预：①空白对照组,②CCL3组,加入CCL350ng/ml,③CCL3及anti-CCL3组(anti-CCL3组),分别加入CCL350ng/ml及CCL3中和抗体5μg/ml。培养后比较三组间细胞数量、形态的差异,Von Kossa’s钙染色计数各组钙结节数量,比较各组成骨潜能。ELISA法检测各组培养上清骨钙素(Osteocalcin,OCN)的浓度,RT-PCR分别检测干预后各组成骨细胞Runx2、Wnt及Osterix mRNA的表达水平并进行组间比较。结果第一部分：1.经地塞米松、β-甘油磷酸钠及维生素C联合诱导培养获得的贴壁细胞形态不规则,有较多突起,碱性磷酸酶染色及Von Kossa’s钙染色均为阳性,提示培养获得的细胞为成骨细胞,经FCM测定细胞表面CD138-CD45-CD34-的表达,证实获得的成骨细胞纯度达90%以上,满足进一步实验需求。培养获得的成骨细胞生长曲线均为S型,MBD患者OB倍增时间约22小时,健康对照组为20小时。ALP染色可见MBD患者阳性细胞数少于正常对照组。Von Kossa’s钙染色后,MBD组钙结节数也少于正常对照组。2.培养获得的成骨细胞表面表达CCL3的受体CCR1,且MBD患者CCR1的表达为(74.48±7.31)%,高于对照组(48.35±8.81)%,差异具有统计学意义。第二部分：1.培养基中加入CCL3干预后,成骨细胞数量、形态无明显变化,钙结节数量减少,矿化能力下降。2.MBD患者成骨细胞培养上清中OCN的表达：CCL3组培养上清中OCN水平为(750.643±41.116)μg/L,较空白组[(803.375±40.654)μg/L]明显减低(P<0.05)；加入拮抗剂组OCN浓度为(787.358±32.063)μg/L,高于CCL3组(P<0.05),与空白组比较无统计学差异。3.MBD患者成骨细胞Runx2.Wnt及Osterix mRNA的表达水平：成骨细胞Runx2mRNA表达与空白组(1.00)比较,CCL3组为(0.4002±0.3734),低于空白组(P<0.01)及anti-CCL3组(0.8670±0.6827,P<0.05),anti-CCL3组表达水平与空白组无统计学差异。Wnt mRNA的表达,CCL3组为(0.7341±0.4432),anti-CCL3组为(0.8246±0.3579),组间比较无统计学差异。Osterix mRNA在CCL3组的表达水平(0.5242±0.2809)低于空白组及anti-CCL3组(0.7993±0.2468)(P<0.05),空白组与anti-CCL3组的表达水平无统计学差异。结论1.采用密度梯度离心分离骨髓单个核细胞,骨髓培养法可体外培养获得MBD患者成骨细胞。MBD患者成骨细胞数量、增长速率及成骨潜能较正常组下降。2.CCL3可抑制成骨细胞分化成熟及其成骨功能,而CCL3中和抗体的出现使CCL3有望成为MBD的新的治疗靶点。