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在乳腺癌中,慢性间歇性缺氧较急性缺氧更为普遍,前者可持续抑制乳腺癌细胞系雌激素受体(ER)-α的表达。但是,慢性间歇性缺氧是否会影响乳腺癌细胞的分子生物学行为以及乳腺癌内分泌治疗敏感性目前尚无深入研究。本课题旨在分子、细胞和体内(动物实验)水平研究慢性间歇性缺氧对人乳腺癌细胞生物学行为以及内分泌治疗敏感性的影响,探索慢性间歇性缺氧引起内分泌耐药的潜在机制,并寻求改善内分泌耐药的可能途径。1.将人乳腺癌ER-a阳性的MCF-7细胞和ZR-75-1细胞以及ER-α阴性的MDA-MB-231细胞在慢性间歇性缺氧环境下长期培养两至三个月,以获得稳定生长的缺氧细胞株。2.观察慢性间歇性缺氧对细胞生物学行为的影响,包括用CCK-8试剂盒测定并绘制细胞的生长曲线以及Transwell小室检测细胞的体外侵袭能力。3.采用CCK-8试剂盒测定并绘制细胞生长曲线的方法分别观察缺氧和正常供氧人乳腺癌细胞对雌激素和氟维司群(ICI 182,780,Tocris)这两种药物敏感性的差异。4.采用RT-PCR和’Western blot方法分别在mRNA和蛋白质水平检测缺氧和正常供氧人乳腺癌细胞中ER信号转导通路和缺氧反应调控通路的变化,探究慢性间歇性缺氧引起乳腺癌内分泌耐药的潜在机制。1.分别观察华蟾素对缺氧和正常供氧人乳腺癌细胞株生物学行为的影响,包括用CCK-8试剂盒测定并绘制细胞的生长曲线、FCM法分析细胞周期分布以及Transwell小室检测细胞的体外侵袭能力。采用RT-PCR和Western blot方法分别在基因和蛋白质水平检测周期素表达水平,探讨华蟾素可能的作用机制。2.将华蟾素和蛋白酶体抑制剂Bortezomib(LC Laborataries)分别作用于人乳腺癌MCF-7缺氧细胞和正常供氧细胞,观察这两种药物对氟维司群(ICI 182,780,Tocris)内分泌治疗敏感性的影响。采用RT-PCR和Western blot方法分别在基因和蛋白质水平检测ER信号转导通路和缺氧反应调控通路中相关指标的表达水平,探讨华蟾素和Bortezomib(LC Laborataries)改善氟维司群(ICI 182,780,Tocris)内分泌耐药的可能作用机制。3.采用改良型小干扰RNA(siRNA)即StealthTM RNAi(Invitrogen)技术抑制人乳腺癌MCF-7缺氧细胞株的HIF-1α表达,观察干扰前后细胞对氟维司群(ICI182,780,Tocris)内分泌治疗敏感性的变化。采用RT-PCR、实时荧光定量PCR和Western blot方法分别在mRNA和蛋白质水平检测ER信号转导通路和缺氧反应调控通路中相关指标的表达水平,探究siRNA通过抑制HIF-1α后改善内分泌耐药可能的作用机制。1.分别建立人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231缺氧细胞株的裸鼠原位移植瘤模型,观察慢性间歇性缺氧细胞株与正常供氧细胞株所成移植瘤在增殖特征上的差异。2.将氟维司群(AstraZeneca)分别作用于人乳腺癌MCF-7缺氧细胞株和正常供氧细胞株所建立的裸鼠原位移植瘤模型,在活体内观察慢性间歇性缺氧对乳腺癌氟维司群内分泌治疗敏感性的变化。3.采用免疫组化方法检测人乳腺癌MCF-7缺氧细胞株和正常供氧细胞株在裸鼠体内所成移植瘤的相关生物学指标表达水平。1.通过长期慢性间歇性缺氧培养,获得了稳定生长的人乳腺癌MCF-7、ZR-75-1和MDA-MB-231缺氧细胞株。2.人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231的缺氧细胞株与正常供氧细胞株相比,其增殖速度均明显加快(P<0.05)。但在ZR-75-1细胞中却未发现这一现象。3.人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231的缺氧细胞株细胞与正常供氧细胞株相比,其侵袭能力均明显增强(P<0.05)。4.雌激素可明显促进人乳腺癌MCF-7正常供氧细胞株的增殖,但是雌激素对于MCF-7缺氧细胞株则未发现有促进增殖作用。5.人乳腺癌MCF-7正常供氧细胞株氟维司群的半数抑制浓度(IC50)为60nmol/l,而MCF-7缺氧细胞株的IC50为800nmol/l,即氟维司群对MCF-7缺氧细胞株的抑制增殖作用与正常供氧细胞株相比明显下降。6.与人乳腺癌MCF-7正常供氧细胞株相比,其缺氧细胞株的HIF-1α、CA-IX和GAPDH的mRNA和蛋白水平均上调,而FIH-1和ER-α的mRNA和蛋白水平则均下调。1.华蟾素对正常供氧状态人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的增殖能力均有明显的抑制作用(IC50分别为0.57mg/ml和0.31mg/ml),并且该抑制作用具有时间依赖性和剂量依赖性。2.华蟾素对正常供氧状态人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的侵袭能力有显著抑制作用(P<0.05)。3.正常供氧状态人乳腺癌细胞MDA-MB-231经过华蟾素处理后,其细胞周期分布可有显著改变,主要表现为S期细胞阻滞。4.正常供氧状态人乳腺癌细胞MDA-MB-231经过华蟾素处理后,无论在mRNA还是蛋白质水平,其cyclin A1、cyclin D1及cyclin E1的表达明显减少,cyclinB1的表达无明显变化,而p21的表达则有所增加。5.华蟾素可显著抑制人乳腺癌细胞MCF-7缺氧细胞株的增殖能力(IC500.54mg/ml)。6.华蟾素可显著改善人乳腺癌细胞MCF-7缺氧细胞株对氟维司群的耐药。缺氧细胞株经华蟾素处理后,无论在mRNA还是蛋白质水平,HIF-1α和CA-IX的表达均较未经处理的缺氧细胞株下降,而ER-a和FIH-1的表达则有所上调,且经华蟾素处理后缺氧细胞株ER-a的表达水平基本与正常供氧细胞相似。7.Bortezomib可显著改善人乳腺癌细胞MCF-7缺氧细胞株对氟维司群的耐药,而Bortezomib、华蟾素和氟维司群三药联合使用可取得比Bortezomib和氟维司群两药联合更好的抑制作用(P<0.05)。缺氧细胞株经Bortezomib处理后,HIF-1α和CA-IX的表达均较未经处理的缺氧细胞株下降,而ER-α的表达则有所上调,与华蟾素改善缺氧细胞株氟维司群耐药的机制相类似。8.采用StealthTM RNAi技术干扰人乳腺癌细胞MCF-7缺氧细胞株的HIF-1α表达后,其对氟维司群的敏感性较未经干扰的对照组显著提高；并且,干扰后HIF-1α和CA-IX的表达均较未经干扰的缺氧细胞株明显下降,而ER-a的表达则有所上调。1.人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231的缺氧细胞株和正常供氧细胞株在成瘤率上无明显差异,但与正常供氧细胞株相比,缺氧细胞株所成移植瘤的生长速度均明显加快,且肿瘤体积明显增大(P<0.05)。2.人乳腺癌MCF-7正常供氧细胞株所成移植瘤经过氟维司群药物治疗后,与对照组相比其生长速度受到明显抑制,且肿瘤体积明显缩小(P<0.05)；然而MCF-7缺氧细胞株所成移植瘤在经过氟维司群药物治疗后,其生长速度和肿瘤体积均与对照组无明显差异(P>0.05)。3.与人乳腺癌MCF-7正常供氧细胞株所成移植瘤相比,MCF-7缺氧细胞株所成移植瘤中缺氧相关指标HIF-1α和CA-IX的免疫组化染色评分明显较高(10.25±1.67 vs. 1.29±1.11,9.13±2.03 vs.2.29±1.11；P均<0.05),而FIH-1和ER-a的评分则较低(2.14±1.35 vs. 9.50±1.60,2.86±2.04 vs. 8.38±1.92；P均<0.05)。慢性间歇缺氧可以促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力,可能是ER-α阳性乳腺癌内分泌治疗耐药的潜在机制之一。华蟾素和蛋白酶体抑制剂Bortezomib均可通过抑制HIF-1α介导的缺氧反应调控通路来显著改善氟维司群耐药,为临床实践提供一条新的治疗策略。