核盘菌弱毒株DT-8生物引发油菜种子技术研发及其促进油菜抗病机理

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:young1592
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作为油菜中的首要病害,由核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]引起的油菜菌核病(Sclerotinia stem rot,SSR)严重影响油菜的产量和质量,威胁油菜的生产安全。核盘菌菌株DT-8携带核盘菌低毒相关DNA病毒1(Sclerotinia sclerotiorum hypovirulence associated DNA virus 1,Ss HADV-1),田间喷施其菌丝悬液,可以有效地降低油菜菌核病的发生,显著地增加产量。但在实际使用中,核盘菌DT-8菌丝悬液较短的货架期严重阻碍了其大规模推广应用。本研究将种子引发技术与生物防治策略相结合,开发利用核盘菌菌株DT-8菌丝悬液进行油菜种子生物引发的新技术,并研究其对油菜菌核病的防控效果及防控机制,打造油菜菌核病防控的新模式。通过基于Box-Behnken设计的响应面优化法,成功的筛选出利用核盘菌病毒性弱毒菌株DT-8菌丝悬液进行油菜种子生物引发的最适条件。最优条件为:油菜种子与核盘菌DT-8菌株菌丝悬浮液(p H 2.5)的比例为2:1(w/v),处理温度为20℃,处理时间为18 h。油菜种子经核盘菌菌株DT-8菌丝悬液生物引发后,其发芽能力显著增强,出苗能力没有受到不利影响。通过贮藏实验,发现将经生物引发的油菜种子在室温环境下贮藏9 wk后,播种于营养土中生长14 d,油菜幼苗的Ss HADV-1携带率依然超过50%。因此,成功地延长了货架期。油菜种子利用核盘菌菌株DT-8的菌丝悬液进行生物引发后,在其幼苗中依然可以检测到Ss HADV-1的存在,预示着核盘菌菌株DT-8可以在油菜体内生存。为了探究引发后核盘菌DT-8菌株的生存状态,使用标记有m Cherry红色荧光蛋白且具有潮霉素磷酸转移酶基因的核盘菌DT-8RFP菌株进行油菜种子生物引发。随后利用激光共聚焦显微镜对经生物引发的油菜幼苗的根部进行观察。发现在油菜的根表和根内,均可以观察到核盘菌DT-8RFP的定殖;从经生物引发的油菜幼苗的子叶和下胚轴,可以重新分离到核盘菌DT-8RFP。将核盘菌DT-8RFP菌株接种在油菜下胚轴,可以在下胚轴的表面和内部观察到核盘菌DT-8RFP。结果表明经种子生物引发后,核盘菌菌株DT-8可以在油菜体中定殖。核盘菌菌株DT-8还具有在油菜下胚轴中内生生长的能力。这为油菜菌核病的防治奠定了基础。在温室中进行的室内防效实验显示,油菜种子生物引发处理可以显著的降低油菜菌核病的发生。于2016年至2018年,在湖北省武汉市华中农业大学试验田和湖北省鄂州市峒山村实验田进行的两年两地的田间防效实验显示,油菜种子生物引发处理可以有效地控制油菜菌核病,防效为19.83%-31.12%。同时,还可以显著地增加产量,增产效果达13.52%-27.76%。油菜种子生物引发处理的防病增产效果,与在盛花期喷施一次杀菌剂咪鲜胺的效果相当。证明利用油菜种子生物引发进行油菜菌核病的生物防治是有效可行的,是利用种子引发技术控制植物气传病害的又一成功案例。利用绝对定量互作转录组测序技术,通过比较核盘菌菌株DT-8与油菜共生时,以及强致病力的核盘菌菌株DT-8VF侵染油菜时,核盘菌和油菜基因的表达差异,探究了核盘菌菌株DT-8与油菜的共生机制。与在PDA上培养时相比,核盘菌菌株DT-8在油菜中定植时,有1022个核盘菌基因上调表达,1069个下调表达。与未经任何处理的对照组油菜相比,核盘菌菌株DT-8在油菜中定植时,有1816个油菜基因上调表达,72个下调表达。对这些差异表达的基因进行GO富集分析、KEGG富集分析、油菜中芸薹宁合成关键基因和核盘菌糖转运蛋白的预测,以及核盘菌细胞壁降解酶基因、分泌蛋白基因、草酸代谢相关基因、解毒相关基因表达量的分析,我们发现:一方面,核盘菌菌株DT-8在细胞壁降解酶、多种分泌蛋白、草酸以及多种解毒机制的帮助下,在油菜中成功定殖,并通过葡萄糖淀粉酶和多种糖转运蛋白,利用油菜中的淀粉作为营养物质;另一方面,又由于生长速率和类固醇生物合成能力的降低,不引起油菜产生病症。此外,油菜也在积极的调控核盘菌菌株DT-8的生长。在油菜通过激活自身果胶脂酶和果胶裂解酶促进核盘菌菌株DT-8定殖的同时,又激活多种抗病反应,严格的控制核盘菌菌株DT-8的生长。而这些抗病反应的激活也增强了油菜抵御其他病原菌的能力。通过基于16S r RNA基因、ITS区域测序的扩增子测序技术,我们探究了在田间环境下,油菜种子生物引发处理对罹患油菜菌核病的油菜主茎的微生物群落的影响。通过α多样性分析、β多样性分析和物种组成分析,发现油菜种子生物引发处理和油菜菌核病均可以改变油菜主茎微生物的群落结构和物种组成,但油菜菌核病的影响更大一些。经种子生物引发后,油菜主茎中的核心微生物和关键微生物均发生了变化;油菜主茎中多种可能的病原菌的丰富降低,特别是核盘菌属真菌。此外,通过构建属水平的微生物互作网络,发现种子生物引发处理还可以影响微生物之间的相互作用,增强微生物互作网络的连通性和强度。而这可能是油菜种子生物引发可以防控油菜菌核病的原因之一,也是一种新的生防机制。本研究首次使用真菌病毒性弱毒菌株进行种子生物引发,并在植物病害防控和产量增加上取得了良好的效果,为利用种子引发技术和真菌病毒进行植物病害防控提供了新的方向。同时,还探究了核盘菌DT-8与油菜之间的互作机制,并从微生物群落变化的角度揭示了生物防治策略的抗病机制。为进一步开发以真菌病毒为基础的生物防治策略提供了新的思路,为实际应用奠定了基础。
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