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麦长管蚜Sitobionavenae(Fabricius)和瓜蚜AphisgossypiiGlover均属半翅目(Hemiptera)胸喙亚目(Sternorrhyncha)的昆虫，分别主要为害小麦和棉花，使二者产量和品质下降，造成严重的经济损失。目前蚜虫的主要防治手段依靠化学防治。拟除虫菊酯类杀虫剂具有杀虫谱广、对哺乳动物低毒等特效而被广泛用于防治麦长管蚜和瓜蚜，同时也导致蚜虫对其产生了抗药性。拟除虫菊酯杀虫剂的作用靶标是电压门控钠离子通道(voltage-gated sodium channel)，因此，对蚜虫钠离子通道的研究有助于我们更好地理解蚜虫与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性机制之间的互作关系。本文主要研究克隆麦长管蚜和瓜蚜钠通道基因全长，解析两种蚜虫钠离子通道基因序列，并初步研究蚜虫钠离子通道在体外成功表达的方法和蚜虫钠离子通道辅助蛋白TipE的电压门控性质。从而揭示蚜虫类害虫对拟除虫菊酯杀虫剂产生抗性的分子机制，同时对完善昆虫神经毒理学具有重要的理论意义。研究结果如下:
(1)麦长管蚜钠通道基因序列克隆:通过RT-PCR技术克隆得到麦长管蚜钠通道基因SaNavⅠ、SaNavⅡ和SaTipE(NCBI序列号:MN176137、MN161583和MN198189)，SaNavⅠ开放阅读框(ORF)全长3423bp，共编码氨基酸1141个;SaNavⅡORF全长2874bp，共编码氨基酸958个;SaTipEORF全长1353bp，共编码氨基酸451个。分析可得SaNavⅠ和SaNavⅡ分别包括2个同源结构域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ、Ⅳ。每个结构域均含有6个跨膜片段S1、S2、S3、S4、S5和S6，且在S5-S6之间存在四个保守性氨基酸残基，分别是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)，Ⅲ和Ⅳ之间存在甲硫氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸(Met-Phe-Met，MFM)。对23个SaNavⅠ和18个SaNavⅡ克隆子进行分析，结果表明麦长管蚜钠通道基因存在4个选择性剪切(外显子j、x、y、b)及一对互斥子k，并存在11个RNA编辑位点;SaNavⅠ中还存在两对对连锁位点M915-F1017和L915-Y1017。
(2)瓜蚜钠通道基因序列克隆:通过RT-PCR技术克隆得到瓜蚜钠通道基因AgNavⅠ、AgNavⅡ和AgTipE(NCBI序列号:MN689724、MN685725和MN966969)，AgNavⅠ包含长3447bp的ORF,共编码氨基酸1149个;AgNavⅡORF长2874bp，共编码氨基酸958个;AgTipEORF长为1353bp，共编码氨基酸451个。分析发现AgNavⅠ和AgNavⅡ含4个同源结构域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，其中AgNavⅠ含同源结构域Ⅰ、Ⅱ，AgNavⅡ含同源结构域Ⅲ、Ⅳ，每个结构域包括6个跨膜片段，分别为S1、S2、S3、S4、S5和S6，同源结构域Ⅰ-Ⅳ的S5与S6之间含有DENS四个氨基酸残基，连接同源结构域Ⅲ和Ⅳ之间的多肽链上也含有MFM模块。对23个ANavⅠ和18个AgNavⅡ进行序列分析，发现其存在3种选择性剪切(外显子j、z、b)，并共含有4个RNA编辑位点;AgNavⅠ中同样存在两对连锁位点M915-F1017和L915-Y1017。
(3)功能验证:通过将麦长管蚜钠通道α亚基cRNA与及其辅助蛋白SaTipEcRNA和DmNavcRNA线性化后注入爪蟾卵母细胞(Xenopus oocyte)中进行功能验证。在麦长管蚜和瓜蚜中均有发现M915-F1017和L915-Y1017连锁位点，为探究其功能，我们通过将黑腹果蝇的钠通道通过基因定点突变技术获得的M915-F1017和L915-Y1017的突变体，并在卵母细胞中表达。实验发现M915-F1017记录到Fast电流和I-V电流，而L915-Y1017记录到微弱电流。电生理结果显示，SaTipE和DmTipE均能提高DmNav1的表达量;麦长管蚜钠通道的α亚基与辅助蛋白SaTipE在卵母细胞中共表达时，结果显示其辅助蛋白共表达时电流虽弱，但仍能提高麦长管蚜钠通道的表达量。结果显示将两种昆虫的的钠通道的辅助蛋白TipE对钠离子通道的表达量有显著性提高。
(4)同源性比较:将SaNavⅠ和SaNavⅡ与AgNavⅠ和AgNavⅡ、禾谷缢管蚜钠离子通道基因RpNavⅠ和RpNavⅡ(NCBI序列号:XP026806616和XP026806613)以及DmNav(NCBI序列号:AAB59195)进行多重序列比对。发现SaNavⅠ与DmNav氨基酸序列同源性为66.7％，SaNavⅡ与DmNav的同源性为66％，SaNavⅠ与AgNavⅠ最相似，约为99.90％，其次是MpNavⅠ是97.81％，RpNavⅠ和SaNavⅠ相似率分别达到97.39％;SaNavⅡ与AgNavⅡ最相似，为99.82％，其次是RpNavⅡ是97.90％，MpNavⅡ是96.43％。
(1)麦长管蚜钠通道基因序列克隆:通过RT-PCR技术克隆得到麦长管蚜钠通道基因SaNavⅠ、SaNavⅡ和SaTipE(NCBI序列号:MN176137、MN161583和MN198189)，SaNavⅠ开放阅读框(ORF)全长3423bp，共编码氨基酸1141个;SaNavⅡORF全长2874bp，共编码氨基酸958个;SaTipEORF全长1353bp，共编码氨基酸451个。分析可得SaNavⅠ和SaNavⅡ分别包括2个同源结构域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ、Ⅳ。每个结构域均含有6个跨膜片段S1、S2、S3、S4、S5和S6，且在S5-S6之间存在四个保守性氨基酸残基，分别是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)，Ⅲ和Ⅳ之间存在甲硫氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸(Met-Phe-Met，MFM)。对23个SaNavⅠ和18个SaNavⅡ克隆子进行分析，结果表明麦长管蚜钠通道基因存在4个选择性剪切(外显子j、x、y、b)及一对互斥子k，并存在11个RNA编辑位点;SaNavⅠ中还存在两对对连锁位点M915-F1017和L915-Y1017。
(2)瓜蚜钠通道基因序列克隆:通过RT-PCR技术克隆得到瓜蚜钠通道基因AgNavⅠ、AgNavⅡ和AgTipE(NCBI序列号:MN689724、MN685725和MN966969)，AgNavⅠ包含长3447bp的ORF,共编码氨基酸1149个;AgNavⅡORF长2874bp，共编码氨基酸958个;AgTipEORF长为1353bp，共编码氨基酸451个。分析发现AgNavⅠ和AgNavⅡ含4个同源结构域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，其中AgNavⅠ含同源结构域Ⅰ、Ⅱ，AgNavⅡ含同源结构域Ⅲ、Ⅳ，每个结构域包括6个跨膜片段，分别为S1、S2、S3、S4、S5和S6，同源结构域Ⅰ-Ⅳ的S5与S6之间含有DENS四个氨基酸残基，连接同源结构域Ⅲ和Ⅳ之间的多肽链上也含有MFM模块。对23个ANavⅠ和18个AgNavⅡ进行序列分析，发现其存在3种选择性剪切(外显子j、z、b)，并共含有4个RNA编辑位点;AgNavⅠ中同样存在两对连锁位点M915-F1017和L915-Y1017。
(3)功能验证:通过将麦长管蚜钠通道α亚基cRNA与及其辅助蛋白SaTipEcRNA和DmNavcRNA线性化后注入爪蟾卵母细胞(Xenopus oocyte)中进行功能验证。在麦长管蚜和瓜蚜中均有发现M915-F1017和L915-Y1017连锁位点，为探究其功能，我们通过将黑腹果蝇的钠通道通过基因定点突变技术获得的M915-F1017和L915-Y1017的突变体，并在卵母细胞中表达。实验发现M915-F1017记录到Fast电流和I-V电流，而L915-Y1017记录到微弱电流。电生理结果显示，SaTipE和DmTipE均能提高DmNav1的表达量;麦长管蚜钠通道的α亚基与辅助蛋白SaTipE在卵母细胞中共表达时，结果显示其辅助蛋白共表达时电流虽弱，但仍能提高麦长管蚜钠通道的表达量。结果显示将两种昆虫的的钠通道的辅助蛋白TipE对钠离子通道的表达量有显著性提高。
(4)同源性比较:将SaNavⅠ和SaNavⅡ与AgNavⅠ和AgNavⅡ、禾谷缢管蚜钠离子通道基因RpNavⅠ和RpNavⅡ(NCBI序列号:XP026806616和XP026806613)以及DmNav(NCBI序列号:AAB59195)进行多重序列比对。发现SaNavⅠ与DmNav氨基酸序列同源性为66.7％，SaNavⅡ与DmNav的同源性为66％，SaNavⅠ与AgNavⅠ最相似，约为99.90％，其次是MpNavⅠ是97.81％，RpNavⅠ和SaNavⅠ相似率分别达到97.39％;SaNavⅡ与AgNavⅡ最相似，为99.82％，其次是RpNavⅡ是97.90％，MpNavⅡ是96.43％。