研究背景和目的细胞内信号传递过程是细胞对外界刺激产生反应并最终引发特异性生物学效应的有效方式。目前发现的主要与炎症过程相关的信号转导途经有4条：丝裂原活性蛋白激酶(mitogen-actirated protein kinase，MAPK)途径，磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidylino-sitol 3’-kinase，P13)激酶途径，核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)途径，JaK-信号转导子和转录激活子(JAK-STAT)途径；其中Jak／STAT信号途径是重要的细胞因子信号转导通路，Jak蛋白酪氨酸激酶(JaRus protein tyrosine kinase)可在细胞因子受体与相应配基结合后活化，并进而激活另一种信号蛋白分子“信号转导子和转录激活子”(signal transducer and activator of transcriDtion，STATs)而诱导目的基因表达。目前发现的Jak家族包括JAK1、JAK2、JAK3、和TYK2，STAT家族包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6共7个成员。Jak-STAT途径信号转导过程首先是细胞膜上的细胞因子受体与相应的配体结合后，形成同源或异源二聚体，这使得与受体偶联的Jak激酶相互接近并通过交互的Tyr磷酸化作用而活化，活化后的激酶使受体链酪氨酸残基磷酸化，活化的Jak激酶催化受体本身的Tyr残基磷酸化并形成相应的STAT分子与受体复合物结合的“停泊位点”，使STAT得以通过其SH2结构域与受体上的磷酸Tyr残基结合并在Jak激酶的作用下实现其C端Tyr残基的磷酸化。两个磷酸化的STAT分子利用SH2结构域的Arg与磷酸Tyr之间的作用形成同／异二聚体并离开受体进入细胞核，与其他转录调节剂相互作用，与目的基因的启动子区域结合诱导基因的表达，通过胞核内的酪氨酸磷酸酶和／或通过蛋白降解，STAT脱磷酸化，从而终止信号的传导；故STAT蛋白活化的标志是其自身的磷酸化。另外，STAT二聚体转入核内，诱导一系列细胞因子反应性基因的转录，然后翻译为一定功能的蛋白，其中细胞因子抑制因子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)在目前被认为是经典的JAK-STAT系统的反馈抑制物，SOCS是一组细胞因子诱导性蛋白，在正常情况下表达很少或几乎检测不到，而有细胞因子作用于整个转导途径时，激活的STAT会诱导SOCS的表达，所以Jak／STAT途径的激活还表现在它能诱导SOCS的产生。系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是最具有代表性的多系统受累的自身免疫病，主要影响育龄期妇女，病变累及关节肌肉、皮肤、肾脏等多系统、多器官，血清出现多种自身抗体，并有明显的免疫紊乱，严重影响人体健康。SLE的真正病因迄今不明，一般认为是多因性的，遗传因素、性激素和环境因素等相互间错综复杂的作用引起机体免疫调节功能紊乱，导致SLE的发生和持续，使疾病不易缓解。近年来许多研究已经明确干扰素(Interferon，IFN)，包括Ⅰ型IFN(α、β)和Ⅱ型IFN(γ)等在SLE的发病、病理中起重要作用，主要支持点有：①在SLE病人经常发现IFN的水平明显升高并且与疾病的活动性相一致；②恶性肿瘤或肝炎患者在接受重组IFN-α治疗时，可以诱发SLE；③近年来许多研究对于SLE患者进行基因谱分析发现IFN相关基因表达明显升高，并且与疾病活动性相关；④Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN都可促进具有Th-1样作用的IgG亚型例如IgG2a、IgG2b和IgG3的生成，这些IgG亚型可结合消耗补体，在SLE的发病中具有致病性；⑤IFN-α可以诱导SLE病人外周血的单核细胞成为具有高度抗原呈递功能的树突状细胞，从而破坏了自身免疫耐受或进一步增强针对自体的体液免疫；⑥许多动物实验通过转基因或治疗性干预SLE的动物模型表明IFN-γ在促进自身抗体生成，特别是在狼疮肾炎的病理过程中起重要作用。总之，IFN在SLE病理生理中的重要地位已经得到确认，并且成为治疗SLE的靶因子。目前研究已经证实Jak-STAT途径是IFN信号传导的重要途径，其中STAT1是IFN-α和IFN-γ发挥其生物学作用的共同的信号转导分子，一直以来有许多研究发现Jak-STAT途径的活化参与细胞增殖、分化、凋亡等过程，所以在肿瘤、慢性炎症如肝炎等Jak-STAT途径的异常活化及对细胞因子的失调控反应所造成的细胞的异常生长或分化均参与了疾病的发生发展。近年来研究发现，在很多慢性炎性疾病特别是有自身免疫因素参与的疾病STATI的活化在疾病的病理生理过程中起重要作用，调控STAT1的生物学作用将成为一个新的抗炎性反应措施。由于上述IFN在SLE中的重要作用及STAT在IFN信号转导中的重要地位，推测STAT1的活化可能在SLE的发病机制中有重要作用。然而迄今为止JAK／STAT1信号转导途径在SLE中的作用却缺乏研究，本研究将通过测定狼疮小鼠不同器官(肾脏、脑、肺脏)STAT1蛋白的活化即磷酸化水平探讨Jak／STAT1途径的表达和活化，通过测定Jak／STAT1途径的下游反馈抑制物SOCS1、3基因的mRNA水平和蛋白表达探讨Jak／STAT1途径的调控机制，从而探讨Jak／STAT1途径在狼疮各主要累及器官中所起的作用。近20年来SLE的预后已经大为改观，目前其10年生存率可达80％以上。影响SLE生存率的因素包括性别、年龄、各临床表现、疾病严重程度、治疗方案等多方面，其中狼疮肾炎(LN)的存在及进行性肾功能损害是影响预后的主要因素，根据临床表现有70％以上的病人肾脏受累，若根据病理活检，则几乎所有系统性红斑狼疮均有。肾脏损害，所以LN已经成为最常见的严重并发症和主要死亡原因之一，深入了解LN的发病机制有助于寻找确切有效的治疗手段。LN的治疗仍然是当今的难点问题，目前仍然是以激素和环磷酰胺为主的免疫抑制剂，长期应用副作用较多，人们一直在探索新的免疫抑制药物以改善SLE的长期预后和生存质量。雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)是1975年从吸水链霉菌发酵液中获得的亲脂性的大环内酯类抗生素，现已把其作为器官移植抗排斥作用新药进行Ⅲ期临床试验。从目前动物实验及临床应用的效果看，RAPA是一种疗效好，低毒，无肾毒性的新型免疫抑制剂，由于免疫抑制剂在移植免疫和自身免疫中存在类似的作用机理，环孢霉素A，吗替麦考酚酯(骁悉)，来氟米特，FK506等最初应用于抗移植排斥药物已纷纷进入风湿科的临床，RAPA也有望成为新的抗风湿病药物。然而RAPA的作用机制尚不完全清楚，许多学者体外实验证实RAPA对细胞由G1期至S期的干扰作用是通过不同的细胞因子受体阻断信号传导通路，从而抑制活化T细胞和B细胞的生长因子和细胞因子的作用而实现的。因此本研究将探讨RAPA干预狼疮动物后Jak／STAT1信号传导途径的变化，从而探讨RAPA对SLE动物的治疗作用是否与RAPA对Jak／STAT1通路的影响相关。同时为了进一步验证体内实验的结果，本研究还进行了小鼠肾脏系膜细胞的体外培养和IFN刺激实验、药物阻断实验；从而了解JAK／STAT信号转导途径的抑制剂在SLE发病和治疗中的作用和意义。材料和方法第一部分研究Jak／STAT1信号转导通路在狼疮模型MRL／lpr转基因小鼠各个主要器官中的活化。实验组是12周龄以上MRL／lpr转基因雌性小鼠10只，检测到狼疮肾炎发生时处死动物，进行下一步实验操作，对照组是同龄MRL／+雌性小鼠10只；分别取实验组及对照组小鼠肾脏，采用免疫组化方法研究肾脏中磷酸化STAT1(p-STAT1)的组织分布情况，采用Western Blot方法定量研究p-STAT1蛋白表达，采用SYBR greenⅠreal-time定量PCR研究STAT1反馈抑制物SOCS-1、SOCS-3 mRNA的表达；并用相同方法研究肺脏、脑组织。第二部分通过体内、体外实验研究雷帕霉素治疗MRL／lpr转基因小鼠后对Jak／STAT1通路的阻断作用。将12周龄以上MRL／lpr转基因雌性小鼠分为两组，药物治疗组给予雷帕霉素0.4mg／kg／d，腹腔内注射，共30天；对照组不给予药物治疗，给予等量生理盐水腹腔内注射，共30天，与药物组同时处死。分别取各组小鼠肾脏，采用免疫组化方法研究肾脏中STAT1和磷酸化STAT1(p-STAT1)的组织分布情况，采用Western Blot方法定量研究STAT1和p-STAT1表达，采用SYBR greenⅠreal-time定量PCR研究SOCS-1、SOCS-3mRNA的表达；体外实验取小鼠肾脏培养肾小球和系膜细胞，分别加入干扰素-α(IFN-α)，1U／mL，培养30分钟；或加入干扰素-γ(IFN-γ)，1ng／mL，培养30分钟。采用Western Blot方法检测p-STAT1蛋白表达：并分别测定加入Jak／STAT特异抑制剂AG-490(100μM)或雷帕霉素(50nM)后p-STAT1的活化情况及对干扰素刺激实验的抑制作用。显著性检验水平为0.01或0.05。结果1．第一部分MRL／lpr狼疮鼠肾脏STAT1的活化形式p-STAT1表达升高，与对照组相比有显著意义(P＜0.01)；第二部分非药物治疗组MRL／lpr狼疮鼠肾脏STAT1的总蛋白表达升高，与对照组相比有显著意义(P＜0.01)。2．MRL／lpr狼疮鼠的肺脏p-STAT1，蛋白含量明显升高，与对照组相比有显著意义(P＜0.01)。3．脑组织p-STAT1蛋白表达以小血管为主，用Western Blot方法定量与对照组相比无统计学意义4．肾脏、肺脏和脑组织的SOCS-1、SOCS-3基因mRNA表达均升高5．肾脏的SOCS-1基因mRNA升高程度低于肺脏和脑组织。6．雷帕霉素治疗后MRL／lpr小鼠肾脏的p-STAT1蛋白表达明显降低，SOCS-1基因mRNA的表达降低。7．体外实验发现MRL／lpr狼疮鼠系膜细胞在静止状态下P-STAT1的活化水平很低，IFN-α和IFN-γ均可诱导MRL／lpr狼疮鼠系膜细胞P-STAT1的表达；IFN-γ对系膜细胞p-STAT1的活化作用强于IFN-α。8．雷帕霉素或AG-490均可阻断肾脏MRL／lpr系膜细胞p-STAT1蛋白的活化。9．雷帕霉素或AG-490对IFN-γ引起的STAT1活化几乎完全阻断而对IFN-α引起的STAT1活化起部分阻断作用。结论及意义1．JAK／STAT1信号转导途径的表达和活化在MRL／lpr转基因小鼠的肾脏、肺脏、脑组织小血管中均明显升高，表明JAK／STAT信号转导途径的异常可能参与和促进了SLE各器官病理损害的发生。2．MRL／lpr小鼠脑组织的小血管STAT1信号转导途径明显活化但脑组织表达无显著升高，提示Jak-STAT1可能参与了狼疮脑病小血管炎的病理过程。3．体内和体外实验均提示JAK／STAT1的异常活化在狼疮肾炎的发病中起重要作用。4．狼疮肾炎的病理损害可能与SOCS的负反馈调节作用降低有关。5．狼疮脑病的发病机理不能用一种机制解释，狼疮脑病的病理损害可能与SOCS的负反馈调节作用降低有关。6．雷帕霉素可以降低狼疮肾炎小鼠JAK／STAT1信号转导途径的表达和活化，这可能是雷帕霉素治疗系统性红斑狼疮的机理之一。7．体外实验表明IFN-α和IFN-γ都可能参与了狼疮肾炎的发病。IFN-γ可能在狼疮肾炎的病理损害中起更重要的作用。8．MRL／lpr狼疮鼠系膜细胞中STAT-1可能是IFN-γ主要的信号转导途径，而IFN-α可能会通过多条途径进行信号转导。9．JAK／STAT信号转导抑制剂可能成为治疗系统性红斑狼疮特别是狼疮肾炎的有效药物。10．JAK／STAT和SOCS信号转导途径的研究将可能为系统性红斑狼疮的治疗开创新的思路，有助于研发新的药物，这对于SLE的治疗将具有重大意义。