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目的:膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤,其易局部复发,临床预后并不理想。近年研究发现长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)在肿瘤发生发展中扮演着重要角色。本研究旨在旨深入挖掘与膀胱癌预后密切关联的lncRNAs,通过整合预后lncRNA表达谱及临床指标,构建可直观预测患者生存概率的预后列线图,并初步探索预后lncRNAs在膀胱癌恶性进展中的生物学功能。方法:1.获取癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中膀胱癌患者及健康对照者的RNA表达谱及临床数据,利用R语言“DESeq2”软件包、单因素Cox回归分析和Kaplan-Meier生存分析,初步筛选在膀胱癌中差异表达并与患者预后相关联的lncRNAs作为候选预后相关lncRNAs。2.训练阶段,利用多因素Cox逐步回归分析建立可预测患者预后的lncRNA风险评分模型,运用Kaplan-Meier生存分析、时间依赖性受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)评估该模型对患者预后的预测效能。在验证集中,进一步验证该模型的预测效能,采用多因素Cox回归分析和Kaplan-Meier分层生存分析评估模型的预测独立性。3.运用单因素和多因素Cox回归分析筛选膀胱癌独立预后因素,借助R语言,将以上独立预后因素与lncRNA风险评分模型整合为可视化的预后列线图。通过Bootstrap法进行内部验证,利用一致性指数(concordanceindex,C-index)、校正曲线和时间依赖性ROC曲线评估该列线图的区分度、一致性和预测效能。4.在另一膀胱癌样本集中,应用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测预后相关 lncRNAs 在膀胱癌组织及膀胱正常组织中的表达水平。5.基于功能富集分析,探索预后相关lncRNAs可能涉及的生物学过程及信号通路。选择最具潜在生物学功能的预后相关lncRNA作为研究对象,通过转染特异性siRNA构建其敲低细胞系。6.应用划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验,检测关键预后lncRNA对膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响。进一步利用Western Blot探究该lncRNA调控细胞迁移侵袭的潜在机制。结果:1.从TCGA数据库共下载414例膀胱癌患者和19例健康对照者的RNA表达谱及临床数据,筛选获得826个在膀胱癌组织和正常膀胱组织间差异表达的lncRNAs(differently expressed lncRNAs,DELs),其中 1 1 个DELs与患者总体生存期(overall survival,OS)有统计学意义的关联性。2.在训练阶段,RNF144A-AS1、AC019211.1和ST8SIA6-AS1与患者预后关联最为密切,依据其风险系数建立3-lncRNA风险评分模型:风险评分=(0.228× 表达量RNF144A-AS1)+(0.436 × 表达量AC019211.1)+(0.116 × 表达量ST8SIA6-AS1)。Kaplan-Meier生存分析发现该模型可有效识别OS较短的预后高风险患者(P=3.1E-04)。时间依赖性ROC曲线表明该模型3年与5年生存率的曲线下面积(area under ROC curve,AUC)分别为 0.703(95%confidence interval[CI]:0.593-0.814)和 0.696(95%CI:0.563-0.829)。3.在验证集中,该模型也显示出较好的预测效能,其3年与5年生存率的AUC分别为 0.675(95%CI:0.593-0.759)和 0.678(95%CI:0.576-0.781)。此外,该模型是患者预后的独立危险因素(HR=1.856,P=0.002),分层生存分析发现该模型同样可区分年龄≥65岁亚组、TNM Ⅱ期亚组和TNM Ⅲ期亚组中预后不良的高风险人群。4.多因素Cox回归分析显示,除3-lncRNA风险评分模型外,年龄和TNM分期也为预后的独立危险因素,基于以上因素构建的列线图在训练集和验证集中显现良好的预测效能:C-index分别为0.688和0.682;校正曲线表明该列线图的预测生存概率与实际观察结果基本吻合;当以3年为时间截点,该列线图的AUC达 0.753(95%CI:0.663-0.818),高于 3-lncRNA风险评分模型(AUC=0.675,95%CI:0.592-0.759)、TNM分期(AUC=0.696,95%CI:0.618-0.775)和年龄(AUC=0.559,95%CI:0.469-0.649)。5.在另一独立样本集中,qRT-PCR结果显示,3个预后相关lncRNAs在膀胱癌组织中的表达水平均显著高于膀胱正常组织,与前期生物信息学分析结果一致(all P<0.05)。经相关分析,共获得184个和预后相关lncRNAs共表达的膀胱癌差异mRNAs。GO和KEGG富集分析发现,共表达的DEMs主要涉及细胞外基质组成等生物过程和肿瘤中蛋白聚糖、细胞外基质受体互作等通路,提示预后相关lncRNAs可能影响膀胱癌的侵袭转移。6.综合预后相关lncRNA在膀胱癌中的表达差异情况和共表达DEMs数量,我们将RNF144A-AS1作为后续研究对象。通过转染特异性siRNA,成功构建出RNF144A-AS1敲减细胞系。体外功能实验显示相比于对照组,RNF144A-AS1敲减组细胞的迁移和侵袭能力显著减弱,并伴有上皮细胞标志物(E-cadherin和ZO-1)表达增加和间质细胞标志物(N-cadherin和Vimentin)表达降低。结论:1.本研究系统筛选了与膀胱癌预后相关联的lncRNAs,基于多因素Cox逐步回归分析成功建立了 3-lncRNA风险评分模型,该模型能够有效区分预后不良的高风险患者。2.通过整合3-lncRNA风险评分模型、年龄和TNM分期,本研究建立了可个体化预测膀胱癌患者3年和5年生存概率的预后列线图,该列线图将为膀胱癌的临床诊疗提供新的参依据。3.预后相关lncRNAs可能通过细胞外基质组成等通路参与膀胱癌的恶性演化,其中之一的RNF144A-AS1在膀胱癌中显著上调,并可能影响上皮-间充质转变(epithelial-mesenchymal transition,EMT)而促进细胞的迁移和侵袭。