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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus-associated disease,PCVAD)的重要病原,对我国养猪业造成了巨大的经济损失。猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)能够感染不同年龄的猪,引起胸膜炎、腹膜炎、关节炎、中耳炎、多发性浆膜炎及猪地方性肺炎(Swine enzootic pneumoniae,SEP),严重影响猪只生长性能。该病原体在临床上常与PCV2、PRRSV等病原体混合感染,致使断奶仔猪的死亡率显著升高。目前Mhr和PCV2的共感染特性及其感染机制尚不清楚,阐明这两种病原体协同感染对仔猪的致病性具有重要的临床意义。本研究通过建立Mhr核酸、抗原和抗体等的检测方法,利用实验室分离的Mhr(DL株)与PCV2(PCV2b,YJ株)进行了共感染试验,旨在阐明这两种病原体共感染对仔猪的致病性作用。第一、猪鼻支原体抗体间接ELISA检测方法的建立及应用。为了检测猪血清中Mhr抗体水平,本研究采用脱氧胆酸钠法(DOC)提取Mhr膜蛋白作为包被抗原,建立了用于Mhr血清抗体检测的间接ELISA方法。其特异性为90.5%,敏感性为98.0%。除猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhyo)外,该方法与几种猪病毒阳性血清及副猪嗜血杆菌IV型阳性参考血清均无交叉反应。对Mhr-DL菌株感染巴马猪血清抗体检测表明,Mhr感染后第3 d血清抗体阳转,第35 d时抗体达到高峰,抗体效价为1:6400。用该方法与IDEXX肺炎支原体抗体检测试剂盒平行检测138份现地血清样品,Mhr和Mhp阳性检出率分别为71.0%和44.9%。对来自黑龙江、吉林、山东等地临床送检的457份血清检测结果显示,Mhr阳性率为70.3%,表明我国养猪群Mhr感染十分普遍。第二、抗Mhr膜蛋白的单克隆抗体制备及抗原表位的鉴定。本研究以DOC提取的Mhr膜蛋白免疫BALB/c小鼠,并通过淋巴细胞杂交瘤技术获得了10株能够稳定分泌特异性抗DOC提取膜蛋白的杂交瘤细胞株,依次命名为1B4、1D2、1H8、1H12、2B6、2H2、3G2、3G10、4B7和4H2;MAb亚类鉴定除2H2为IgG2b亚型外均为IgG1亚型,轻链均为κ链;杂交瘤细胞培养液上清效价为1:200~1:400,腹水效价为1:1.0×105~1:2.0×105;Western blot结果显示,其中5株单克隆抗体针对Mhr同一种大小膜蛋白产生特异性反应。经质谱分析、蛋白表达和Western blot鉴定该膜蛋白为Mhr丙酮酸脱氢酶E1复合体α亚基。为了对其抗原表位进行鉴定,通过对Mhr丙酮酸脱氢酶E1复合体α亚基截短表达与人工合成肽相结合的方法对其表位进一步分析,初步确定了3个抗原表位,分别为269SSDNPRIYRTEEEEK283,299KDKKYITDEEIKQIW313和350LKEQKQHAKDY360。第三、Mhr核酸检测SYBR荧光定量PCR方法的建立及其应用。为了检测猪血液及组织中Mhr核酸载量,本研究参考GenBank发表的Mhr P37基因序列设计一对特异性引物,建立了一种能够检测Mhr核酸载量的特异性好、敏感性高的SYBR荧光定量PCR方法。该方法扩增效率为1.04,误差值为0.0189,批内变异系数小于2.0%。与常规PCR相比,本方法敏感性提高100倍以上。该方法与猪圆环病毒1型(PCV1)、PCV2、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和Mhyo均无交叉反应。利用本试验方法对Mhr-DL菌株经气管、腹腔和气管+腹腔感染仔猪21 d后剖杀的各组织中Mhr核酸含量进行检测,发现Mhr核酸主要存在于扁桃体和肺脏中,且腹腔和气管+腹腔感染组试验猪Mhr核酸载量明显高于气管感染组和对照组。第四、PCV2和Mhr共感染试验仔猪的协同致病性试验。为了阐明PCV2和Mhr的协同致病作用及这两种病原体不同时间顺序共感染与其协同致病性之间的关系,试验选用30日龄健康仔猪30头,随机分为6组(每组5头),分别为Mhr-PCV2共感染组、Mhr/PCV2顺序共感染组(感染Mhr 1 w后感染PCV2)、PCV2/Mhr顺序共感染组(感染PCV2 1 w后感染Mhr)、Mhr单感染组、PCV2单感染组及对照组。临床症状观察发现,感染后Mhr-PCV2、PCV2/Mhr、Mhr/PCV2共感染组和Mhr单感染组均能观察到短暂的食欲不振、体温升高、咳嗽、跛行和体重降低。血清抗体检测结果表明,Mhr-PCV2、PCV2/Mhr和Mhr/PCV2共感染组中PCV2和Mhr抗体水平均不同程度高于单感染组和对照组。此外,Mhr-PCV2、PCV2/Mhr和Mhr/PCV2共感染组不同组织中PCV2和Mhr核酸含量、组织器官剖检变化及肺部组织病理变化明显高于单感染组和对照组。细胞因子检测结果表明Mhr-PCV2共感染组中TNF-α、IL-2和IL-6水平明显高于其他各试验组。