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源于T7噬菌体的T7表达系统(T7RNA聚合酶(T7RNAP)/T7启动子）是原核生物中应用最广泛的蛋白表达系统之一，其在合成生物学研究中也有重要的用途。但是，T7表达系统在真核生物酿酒酵母菌中尚未有成功报道，这主要是T7RNAP转录的mRNA在真核细胞中无转录后的加工过程，因而不能穿过细胞核膜进入细胞质。本研究利用逆转录病毒转运元件、加帽酶、病毒孔蛋白增加细胞核核膜通透性等方式构建酿酒酵母的T7表达系统，萤光素酶(Nluc)表达的结果显示，病毒孔蛋白能够有效的促进T7转录产物的运输，提高蛋白质的合成量。本研究课题实验内容包括以下三个部分:
1.分别构建Cas9蛋白能进入细胞核的酿酒酵母菌yNLS-Cas9和细胞质表达Cas9蛋白的酿酒酵母菌yCas9，同时转入带有甲硫氨酸(Met)启动子控制gRNA转录和检测基因EGFP的自主复制型质粒，同时完成酿酒酵母菌株yNLS-Cas9-EGFP-gRNA和yCas9-EGFP-gRNA的构建。多功能酶标仪检测酵母细胞平均荧光强度，当gRNA诱导表达时，Cas9蛋白能进入细胞核的菌株平均荧光强度明显下降，说明含有2μ起始复制位点的酵母DNA质粒存在于酵母细胞核中，后续实验所用质粒基于此结论进行研究。
2.构建表达T7RNAP的酿酒酵母菌株yT7RNAP，随后转入携带Rev-RRE元件和T7启动子控制潮霉素抗性基因（hph）的自主复制型质粒，完成酵母菌yRev-hph-RRE的构建，并和对照菌株yhph相比，发现Rev-RRE元件的引入没有促进菌株表达更多的抗性蛋白，但是对照菌株yhph却能表达抗性蛋白，说明有hph mRNA渗漏出核。基于此发现，用潮霉素B来筛选T7RNAP转录产物能渗漏出核表达的突变体。另外构建了基于CTE元件和加帽酶的T7表达系统，但促进mRNA的运输的效果都不明显。
3.将带有病毒孔蛋白的T7表达质粒pESC-NLS-Vpu-PT7-hph-TT7和pESC-NLS-SCVE-PT7-hph-TT7分别转入重组酵母yT7RNAP，完成酵母菌yNLS-Vpu-hph和yNLS-SCVE-hph的构建。抗性蛋白的表达量比对照菌yhph的表达量高，说明病毒孔蛋白起到了一定作用。萤光素酶(Nluc)作为报告基因也得到了较好的效果，成功表明病毒孔蛋白能改变酿酒酵母细胞核核膜通透性，并促进mRNA的转运至细胞质。
1.分别构建Cas9蛋白能进入细胞核的酿酒酵母菌yNLS-Cas9和细胞质表达Cas9蛋白的酿酒酵母菌yCas9，同时转入带有甲硫氨酸(Met)启动子控制gRNA转录和检测基因EGFP的自主复制型质粒，同时完成酿酒酵母菌株yNLS-Cas9-EGFP-gRNA和yCas9-EGFP-gRNA的构建。多功能酶标仪检测酵母细胞平均荧光强度，当gRNA诱导表达时，Cas9蛋白能进入细胞核的菌株平均荧光强度明显下降，说明含有2μ起始复制位点的酵母DNA质粒存在于酵母细胞核中，后续实验所用质粒基于此结论进行研究。
2.构建表达T7RNAP的酿酒酵母菌株yT7RNAP，随后转入携带Rev-RRE元件和T7启动子控制潮霉素抗性基因（hph）的自主复制型质粒，完成酵母菌yRev-hph-RRE的构建，并和对照菌株yhph相比，发现Rev-RRE元件的引入没有促进菌株表达更多的抗性蛋白，但是对照菌株yhph却能表达抗性蛋白，说明有hph mRNA渗漏出核。基于此发现，用潮霉素B来筛选T7RNAP转录产物能渗漏出核表达的突变体。另外构建了基于CTE元件和加帽酶的T7表达系统，但促进mRNA的运输的效果都不明显。
3.将带有病毒孔蛋白的T7表达质粒pESC-NLS-Vpu-PT7-hph-TT7和pESC-NLS-SCVE-PT7-hph-TT7分别转入重组酵母yT7RNAP，完成酵母菌yNLS-Vpu-hph和yNLS-SCVE-hph的构建。抗性蛋白的表达量比对照菌yhph的表达量高，说明病毒孔蛋白起到了一定作用。萤光素酶(Nluc)作为报告基因也得到了较好的效果，成功表明病毒孔蛋白能改变酿酒酵母细胞核核膜通透性，并促进mRNA的转运至细胞质。