论文部分内容阅读
目的碳纳米管(Carbon Nanotubes,CNTs)是一种非常重要的一维纳米材料,由于其独特的结构和物理化学性质,使得它在汽车制造、平板显示器、生物医药等领域有广阔的应用前景。但是它对生态环境、人类健康的影响目前还不是很清楚,有待于进一步研究。本课题通过对本实验室设计、合成的功能化多壁碳纳米管库进行的细胞毒性研究,发现了碳纳米管的表面修饰基团与细胞毒性之间的剂量效应关系,筛选出生物相容性较好的碳纳米管。在此基础上,以毒性差异较为显著的4种功能化碳纳米管作为研究对象,对其细胞毒性进行深入的探讨,为建立纳米材料的毒性数据库提供重要的参考数据。方法本研究选择人正常皮肤成纤维细胞NHFB(Normal HumanFibroblasts)和人肝癌细胞HepG2作为毒性筛选模型用于功能化多壁碳纳米管库(functionalized multi-walled carbon nanotubes library,f-MWNTs library)的筛选,细胞密度是4000个细胞/孔(96孔板),f-MWNTs的浓度为200μg/mL。本实验首先通过相差显微镜观察细胞形态变化和WST-1方法测定细胞活力,对f-MWNTs库的细胞毒性进行了初步筛选。根据初级筛选结果,选择碳纳米管库中的MWNTs-002、MWNTs-003、MWNTs-004和MWNTs-005这4种功能化碳管进行以下几方面的研究:应用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)观察NHFB细胞对f-MWNTs的摄入及其在细胞内的定位情况;分析了f-MWNTs对细胞内活性氧含量(Reactive Oxygen Species,ROS)的影响;对细胞周期(Cell Cycle,CC)受阻滞的情况进行了研究。结果1.功能化多壁碳纳米管库的细胞毒性筛选f-MWNTs对细胞存活率的影响呈现明显的剂量效应关系,而细胞的存活率则随时间的延长而有所升高;表面修饰有不同官能团的多壁碳纳米管的分散性有所不同,所表现出来的细胞毒性也存在着差异;经过f-MWNTs处理后,细胞存活率均在50%以上。其中以羧基化碳纳米管MWNTs-002对两种细胞活力的影响最为明显,对NHFB细胞和HepG2细胞的存活抑制率分别为47%和40%。2.细胞形态观察通过普通光学显微镜下的观察发现,经f-MWNTs处理的NHFB细胞的形态发生了很大改变。正常情况下,细胞应该呈纤维状,细胞的延展性较好,处理后细胞形态明显变得较为瘦弱,几乎呈丝状分布,细胞的延展性、贴壁性能变差,细胞数目少于对照组。细胞生长受到显著抑制,但没有表现出明显的死亡现象。3.功能化多壁碳纳米管在细胞内的定位MWNTs-002、MWNTs-003、MWNTs-004和MWNTs-005作用于NHFB细胞12h后,能够穿过细胞膜进入细胞质胞浆的空泡内,并引起细胞一定程度的损伤,如细胞核皱缩、细胞膜破损、细胞有凋亡小体出现、线粒体空泡化、细胞核内的常染色质减少等现象。4.细胞内活性氧含量的测定处理组细胞内活性氧含量有所升高,当f-MWNTs的作用浓度大于50μg/mL时,细胞内的活性氧含量显著提高,随处理时间的增长,细胞内活性氧含量反而有所降低。f-MWNTs的处理对细胞内活性氧的产生呈浓度依赖关系,但对处理时间则表现出负相关性。5.细胞周期分布情况不同浓度的羧基化MWNTs作用HepG2细胞12h后,细胞周期分布情况出现轻微的改变,与对照组相比,G0/G1期细胞百分数有所上升,G2/M期细胞百分数下降。其中,200μg/mL MWNTs-002作用于HepG2细胞12h后,G0/G1期细胞百分数为65.86%,而对照组为57.45%。将MWNTs-002、MWNTs-003、MWNTs-004和MWNTs-005以200μg/mL的浓度分别作用HepG2细胞6h、12h、24h和48h,与对照组细胞相比,所引起的细胞周期在G0/G1期的阻滞以12h最为明显。结论1.f-MWNTs的细胞毒性与其表面修饰的化学官能团有关,并且具有剂量依赖性;2.f-MWNTs的细胞毒性主要表现为抑制细胞增殖;3.f-MWNTs能够穿过细胞膜进入细胞,分布在细胞质的空泡内,并对细胞造成一定的损伤;4.f-MWNTs可以引发细胞内活性氧含量的升高,这可能是抑制细胞增殖的原因之一;5.f-MWNTs诱导细胞周期阻滞在G0/G1期,阻滞效果与碳纳米管的表面修饰有关。