肝细胞癌是全世界范围内的一个主要的健康问题,是世界第六位最常见的肿瘤和第三位最常见的癌症相关死亡疾病。全球每年有超过600000例新病例被诊断为肝癌。目前对HCC的根治性治疗方式(例如射频消融和外科手术切除)常因肿瘤的复发转移或是患者就诊时已属于中晚期而难以取得满意的治疗效果。肝移植是对于肝癌特别是合并肝硬化肝癌理想的治疗手段,然而,由于供肝的缺乏,肝移植只能治疗少数HCC患者,特别是对于伴有HCV感染的患者,肝移植常因供肝的再感染而导致治疗的失败甚至加重病情的发展。因此,新的有效的治疗方式可能是提高HCC患者治愈率和降低病死率的希望。丙型肝炎病毒感染是一个重要的公共卫生问题,由于其高患病率和严重并发症——肝硬化和肝癌,严重威胁着人类健康。大量针对病毒相关因素(蛋白酶或聚合酶)和宿主因素的靶向性药物对HCV的慢性感染治疗方面已经取得了较大进展并开始运用于临床,极大的提高HCV的治疗效果。然而,对于接受肝移植的HCV患者,由于抗病毒药物间及与免疫抑制剂的的相互作用而受到明显限制,因此,需要新的治疗方式以预防HCV的移植后再感染,同时提高HCC的治疗效果。目前,过继免疫治疗治疗肿瘤已经成为肿瘤治疗的主要甚至是标准治疗方式,其主要是通过激活或修复机体免疫系统或是通过免疫效应细胞的运用而达到治疗肿瘤的目的。然而,这些方法绝大部分是通过自体免疫细胞,即来源于患者自身的免疫细胞,因此其面临的问题是,这些来自于处于对病原体和／或其他治疗处于免疫抑制的患者免疫细胞,在体外的激活和扩增能力都非常有限,同时,提取的免疫细胞只能运用患者本人,限制了其运用的广泛性,因此并未取得明显的临床效果。目前,免疫治疗的发展极大的受限于免疫效应细胞数量及功能扩增的技术难度及特定的可接受治疗患者,而建立一个备用的异基因细胞库(即来自于不同患者或是健康人群的外周血淋巴细胞,体外扩增或激活以获得更强的免疫活性),由其提供充足的细胞来源,与自体来源的免疫细胞(来源于患者本人)相比无疑将可能促进免疫治疗的发展和运用。我们的本项研究课题,据目前所知,是首次将异基因免疫细胞运用于对实体肿瘤(非血液系统肿瘤)和抗病毒治疗。[研究目的]1.异基因性转基因细胞库的建立：异基因反应性表现为个体的淋巴细胞系统当面对其他个体来源的组织或细胞时,能够对异体的细胞或组织发生反应。异基因反应性可以发挥其诸如抗肿瘤的特性,但也往往带来的严重毒副反应——移植物抗宿主反应。而在异基因免疫效应细胞临床运用之前导入条件性毒性基因,即自杀基因,通过自杀基因的前体药物的使用可以诱导表达自杀基因的异基因过继免疫细胞的死亡,从而控制此毒副反应的发生。目前运用较广泛的自杀基因包括：单纯疱疹病毒腺苷嘧啶激酶(HSV-tk)或是可诱导半胱天冬酶9(iCasp9):由于自杀基因的导入,当出现移植物抗宿主反应时,表达该自杀基因的效应细胞能够被自杀基因前体药物,如更昔洛韦(GCV)或AP1903有效清除。因此,我们拟建立来自于健康供体的自杀基因调控的异基因免疫细胞(aSMKCs)库,对比观察其对HCC和HCV感染的治疗及预防作用。2.对HCC的治疗研究：目前对于HCC的治疗方式很多,但总体的疗效仍不满意,HCC的发病率和病死率仍居高不下,寻找新的有效的治疗方式将可能为HCC的治疗带来新的希望。本课题拟通过体内外等实验,证实aSMKCs对肝癌的抑制作用,同时,对于异基因反应可能出现的主要毒副作用GvHD反应,利用自杀基因的导入可以快速安全的预防,从而为aSMKCs运用于临床治疗HCC提供理论和实验依据。3.预防HCV相关患者肝移植后的移植物HCV再感染：HCV感染最严重并发症为肝硬化及HCC,肝移植是治疗HCV相关并发症的有效治疗措施,然而,对于HCV患者来说,新移植物在移植后短期内的HCV再感染仍是急需解决的棘手问题。本课题将研究aSMKCs的各细胞亚型的细胞分泌功能及其在抗HCV再感染中的作用,为临床治疗HCV移植后再感染提供有效的治疗和预防方式。[研究方法]1.完成aSMKCs细胞的生产：不同逆转录病毒上清的生产,健康供体来源外周血细胞(PBMC)的提取、激活、转染及扩增；运用流式细胞仪对aSMKCs进行细胞亚型分类；免疫磁珠分选法对aSMKCs细胞进行阳性筛选、冻存。2.建立HCC裸鼠原位模型：为更好的对HCC原位裸鼠模型进行研究分析,选择较理想的动物实验方法是后续体内实验的关键,因此,本课题运用SCID、 Balb/c、NMRI-nu裸鼠对比研究经肝脏注射、经门静脉注射和经脾脏注射建立原位肝癌模型的死亡率、成功率,并用MRI结合BLI对比分析证实原位肝癌模型的建立,从而为后续实验的真正原位模型提供理论及实验依据。3.体外研究aSMKCs细胞毒活性：体外对比研究转染自杀基因HSV-tk的aSMKCs及对照组PBMC细胞对经pCLNCX稳定转染的HeLa, Huh7细胞株进行细胞毒实验研究,设置不同浓度和时间段,观察不同细胞因子激活扩增的aSMKCs的体外细胞毒实验。观察自杀基因的转染对aSMKCs细胞毒作用的影响及其前体药物在体外对aSMKCs的凋亡诱导作用。4.研究aSMKCs前体药物对GvHD的预防作用：对比研究aSMKCs在皮下及原位HCC裸鼠模型的抗肿瘤作用,并观察自杀基因前体药物的使用对可能出现的移植物抗宿主反应的预防作用,同时研究aSMKCs的抗HCC作用对免疫抑制剂的抵抗作用。5.建立HCV体外实验模型：为研究表达自杀基因的异基因免疫细胞对HCV的病毒复制抑制作用,我们运用JFH1ΔE1E2-luc质粒转染Huh7.5.1细胞建立HCV复制系统,同时运用和HCVC c-Jc-1建立HCV阳性细胞培养系统,对比研究aSMKCs细胞体外对HCV病毒复制及生产的作用,从而为临床上治疗或预防HCV相关肝移植患者术后再感染提供理论及实验依据。6.体外研究aSMKCs对HCV的抑制作用机制：体外研究aSMKCs对HCV复制系统和细胞培养系统HCV病毒生产的抑制作用,运用单克隆抗体检测其病毒抑制作用的机制,并观测免疫抑制剂对该作用的影响。[研究结果]1.运用MP71-T34FT质粒和SFG.iCasp9.2A. Δ CD19质粒,成功生产表达HSV-tk/CD34和iCasp9/CD19逆转录病毒上清并成功转染PBMC,免疫磁珠阳性筛选可提高aSMKCs的效应细胞纯度,免疫磁珠筛选前后的aSMKCs比例分别为9.1±0.8%和89.4±1.2%,其中T细胞、NK细胞和NKT细胞转染前分别为65.5+/-1.8,7.2+/-1.1,11.2+/-1.0,转染后为77.3+/-3.2,11.1+/-1.6,5.3+／-2.0(均数±标准差),建立表达不同自杀基因的异基因免疫杀伤细胞细胞库。2. aSMKCs对自杀基因前体药物的敏感性：对比自杀基因前体药物的运用对aSMKCs细胞的凋亡诱导作用,(1μg/ml)GCV对HSV-tk/CD34+和(10nM)CID对CD19/iCasp9+aSMKCs的抑制率分别为92.5%和95%,而对PBMC无明显作用。3.三种不同方式IPT(经门静脉注射)、IS(经脾注射)和m(经肝叶注射)在裸鼠体内建立原位HCC模型的死亡率：手术中(D。)分别为16%,6%和3%,p<0.05。术后死亡率三组分别为25%,3%and 2%, P<0.01,而IS组和IH组在术后死亡率无明显差异(3% vs 2%,p>0.05)。通过MRI和BLI对原位HCC的分析,IH、IS和IPT的有效建立原位HCC模型的比例分别为52%vs 32%vs 19%,p<0.05。4. aSMKCs体外具有明显抗HCC作用,自杀基因的转染对aSMKCs的异基因细胞毒活性无影响,其抗HCC作用为非MHC-I类分子限制性,主要的效应细胞为NKT细胞和NK细胞,免疫抑制剂对aSMKCs细胞毒活性无明显影响,aSMKCs可以为自杀基因前体药物快速诱导消除以预防GvHD。5.体内研究表明,转染了自杀基因的aSMKCs细胞体内有明显趋肝性,在HCC皮下和原位模型均具有明显抗HCC作用,病理学证实其主要效应细胞为NKT和NK细胞,其抗HCC的作用不受免疫抑制剂影响。自杀基因前体药物可体内快速消除表达自杀基因的aSMKCs细胞,从而安全有效预防GvHD作用。6,运用HCV复制系统和HCVcc系统证实,aSMKCs细胞在体外有明显抗HCV复制及病毒生产的作用,其作用的发挥依赖IL-2,主要效应细胞为NKT细胞和NK细胞,其作用的发挥通过细胞分泌的细胞因子IFN-γ,而IFN-α或IFN-β则无明显抗HCV作用,aSMKCs细胞抗HCV作用可拮抗免疫抑制剂,自杀基因前体药物可快速消除aSMKCs而发挥预防GvHD作用,表达iCasp9自杀基因系统的aSMKCs其消除在体外明显快于表达HSV-tk系统,表现出更好的安全性。[研究结论]1.运用不同的逆转录病毒载体,可以建立来源于健康供体的表达自杀基因的异基因免疫杀伤细胞库(aSMKCs),可为临床治疗包括HCC在内的实体肿瘤和预防HCV感染提高实验及理论基础。2. aSMKCs在体外有明显的抗肿瘤作用,与对照组相比,自杀基因的导入对异基因免疫细胞的细胞毒作用无明显影响；3.通过三种不同方式的对比,经肝脏注射是建立裸鼠原位肝癌模型的最佳方式,具有低死亡率及HCC模型成瘤率,但其成瘤部位相对局限；根据不同的实验目的和要求,选择合适的HCC裸鼠原位模型是非常有必要的。4. aSMKCs在体内有明显的抗HCC的作用,且该作用的发挥呈IL-2依赖,其抗肿瘤作用及不受免疫抑制剂的影响,抗肿瘤的主要效应细胞为NK及NKT细胞。5. aSMKCs在体外有明显抑制HCV复制和生产的作用,其作用的发挥亦呈IL-2依赖,并主要通过NK及NKT细胞分泌的IFN,该作用可拮抗目前常用的免疫抑制剂。6.自杀基因的前体药物能够诱导表达自杀基因的aSMKCs效应细胞凋亡,其中iCasp/9-CID自杀基因的诱导时间明显快于HSV-tk-GCV系统,从而能更有效预防移植物抗宿主反应的发生