等温扩增检测HBV S基因方法的建立及临床应用的初步研究

来源 :西北大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:pengxianwei1986
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因输入含有病毒的血液或血液制品而感染的艾滋病、乙肝、丙肝等疾病的现象,已引起社会的高度重视。目前最主要的任务就是严格控制对外来血源的筛查,传统的ELISA方法检测血液传播疾病的方法仍在不同方面存在局限性,如检测通量低、耗时长、灵敏度较低等。而荧光定量PCR法检测也存在着检测成本高、对设备要求高等缺点,不利于在基层血站及医院推广。本研究采用等温扩增技术,应用生物素—链亲和素系统富集靶序列,目的在于建立一种灵敏度高、特异性强的检测低拷贝数核酸样本的方法.。本研究由HBV S基因的表达载体GS115-pPICZS酵母细胞中提取酵母总RNA。使用偶联有捕获探针的链亲和素磁粒,通过亲和素-链生物素反应,与靶核苷酸相连,富集样品中的HBV S基因的的mRNA。以等温扩增技术扩增HBVS基因mRNA。扩增产物由1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。通过优化等温扩增体系,该技术检测HBV S基因mRNA的扩增倍数可达10~8数量级、灵敏度可达到2pg/mL,高于逆转录PCR 200 pg/mL的灵敏度。应用该研究所建立的磁粒富集靶序列和等温扩增技术,选取经荧光定量PCR分析HBV DNA含量大于1.0×10~3拷贝/mL的血清标本,进行HBV DNA的检测,结果对于HBV的检测及HBV的分子生物学、分子流行病学研究有重要的意义。等温扩增反应体系在HBV S基因mRNA及血清标本中HBV DNA的检测过程中具有良好的灵敏度、特异性。不仅能够有效检测HBV S基因mRNA及血清标本中的HBV DNA,而且对于其它低拷贝数的核酸样本的检测同样具有重要价值和意义。该技术有潜力取代PCR技术,成为核酸样本扩增的主要手段。
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