论文部分内容阅读
目的构建人FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体，检测人FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体在HT-1080细胞表面可调控的稳定表达，并初步研究其对B细胞功能的影响。方法以人mRNA为模版逆转录获得FcγRⅡB基因片段，并将其克隆入慢病毒表达质粒TRE，构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒。将慢病毒表达重组质粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒调节质粒Tet分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞，分别包装表达病毒和调节病毒，分别测定表达病毒和调节病毒感染滴度。表达病毒和调节病毒共感染HT-1080细胞，经梯度浓度强力霉素（Dox）诱导，免疫荧光染色检测HT-1080细胞表达FcγRⅡB，实时定量PCR检测FcγRⅡB mRNA表达，Western blot法检测FcγRⅡB蛋白表达。表达病毒和调节病毒共感染Ramos细胞，经1000ng/mL强力霉素（Dox）诱导，免疫荧光检测FcγRⅡB的表达和FcγRⅡB与SLE患者血清免疫复合物（IC）中IgG Fc端的结合能力。LPS刺激感染后的Ramos细胞，ELISA法检测过表达FcγRⅡB对Ramos细胞分泌IgM抗体的影响。结果重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定，测序结果显示插入片段碱基序列与GenBank提供FcγRⅡB基因序列同源性100%。表达病毒滴度达106TU/mL，调节病毒滴度达105TU/mL，感染性良好。HT-1080细胞被病毒感染后经Dox诱导表达FcγRⅡB，免疫荧光染色结果显示FcγRⅡB能够在HT-1080细胞表达；实时荧光定量PCR和Western blot法结果显示FcγRⅡB表达水平与诱导剂浓度正相关。免疫荧光结果显示病毒感染后，Ramos细胞过表达FcγRⅡB且与IC中IgG Fc端有较好的结合能力。ELISA结果显示过表达FcγRⅡB会下调Ramos细胞的IgM分泌水平。结论成功构建了FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体。经该慢病毒感染后Ramos细胞过表达FcγRⅡB且能下调该细胞分泌IgM型抗体的水平。