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背景急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）可由肺内及肺外多种因素诱发。虽然人们不断致力于研究ARDS的药物和非药物治疗手段,但其发病率和死亡率仍居高不下。ARDS的高病死率和有效治疗手段的匮乏导致其为困扰临床特别是重症临床的一个棘手的问题。ARDS的发病机制复杂不明,包括各种体内外因素诱发的来自先天和获得性免疫系统的各种免疫细胞参与反应,释放多种细胞因子形成炎症风暴,导致肺微血管通透性增加,最终诱发非心源性肺水肿,引起患者的呼吸衰竭和呼吸窘迫感。然而炎症网络复杂,难以寻找一个确切的炎症因子作为分子治疗靶点,故我们设想能否从导致ARDS肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs）通透性增加这个角度来探索ARDS的发病机制,期待从复杂炎症和免疫反应的下游寻找治疗ARDS的分子靶点。目的1.观察Ezrin蛋白在炎症免疫细胞因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）诱导的PMVECs高通透性中的分布和表达水平的变化。2.探索Ezrin蛋白是否通过Ras同源基因家族,成员A（Ras homolog gene family,member A,RhoA）或者粘着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）信号通路参与TNF-α诱导的PMVECs通透性增加。3.检测RhoA信号通路和FAK信号通路在TNF-α诱导的PMVECs通透性增加中的关联性。方法1.分离并培养大鼠PMVECs,通过倒置显微镜观察大鼠PMVECs的形态并结合异硫氰酸标记的植物凝集素（Fluorescein isothiocyanate phytohemagglutinin,FITC-BSI）方法鉴定大鼠PMVECs。2.将大鼠PMVECs接种于Transwell小室并培养,用来构建大鼠PMVECs体外单层模型。3.观察大鼠PMVECs单层对TNF-α刺激的反应3.1 TNF-α刺激后大鼠PMVECs的跨内皮细胞电阻（transendothelial electrical resistance,TER）的变化。3.2 TNF-α处理后大鼠PMVECs中的Ezrin蛋白和磷酸化Ezrin蛋白表达水平的变化。4.Ezrin短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）在TNF-α诱导PMVECs内皮反应中的作用4.1用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪观察Ezrin shRNA对TNF-α诱导PMVECs Ezrin蛋白和磷酸化Ezrin蛋白分布的影响。4.2用western blotting法检测Ezrin shRNA对TNF-α诱导PMVECs Ezrin蛋白和磷酸化Ezrin蛋白表达水平的影响。4.3观察Ezrin shRNA对TNF-α诱导PMVECs内皮通透性的影响（检测TER和异硫氰酸荧光素标记牛血清白蛋白（fluorescein isothiocyanate-bovine serum albumin,FITC-BSA）的变化）。5.Ezrin蛋白苏氨酸567位点突变体（EzrinT567A）在TNF-α诱导PMVECs内皮反应中的作用5.1观察EzrinT567A对TNF-α诱导PMVECs Ezrin蛋白和磷酸化Ezrin蛋白分布的影响。5.2检测EzrinT567A对TNF-α诱导PMVECs Ezrin蛋白和磷酸化Ezrin蛋白表达水平的影响。5.3观察EzrinT567A对TNF-α诱导PMVECs内皮通透性的影响。6.RhoA或FAK信号通路在TNF-α诱导Ezrin蛋白磷酸化和内皮通透性中的作用6.1观察RhoA或FAK抑制剂对TNF-α诱导Ezrin蛋白磷酸化水平和内皮通透性变化的影响。6.2构建RhoA shRNA或FAK shRNA载体转染大鼠PMVECs,观察RhoA shRNA或FAK shRNA对TNF-α诱导Ezrin蛋白磷酸化和内皮通透性变化的影响。7.观察RhoA信号通路和FAK信号通路有无上下游关系7.1 RhoA shRNA处理后观察TNF-α刺激PMVECs后FAK水平的变化。7.2 FAK shRNA处理后观察TNF-α刺激PMVECs后RhoA水平的变化。结果1.倒置显微镜下见大鼠PMVECs呈铺路石样形态,FITC-BSI处理后倒置荧光显微镜下观察呈日晕般的绿色荧光。2.TNF-α诱导大鼠PMVECs电阻和Ezrin蛋白磷酸化呈时间和浓度依赖性变化不同时间点（0,0.25,0.5,1,2,3,6,12 h）和不同浓度（0,0.2,2,20,200 ng/ml）的TNF-α刺激后可诱导TER呈时间和浓度依赖性降低。TNF-α刺激PMVECs的磷酸化Ezrin蛋白呈时间和浓度依赖性增加,而Ezrin蛋白的表达水平却不受影响。3.Ezrin蛋白敲减部分逆转TNF-α诱导的内皮反应用western blotting检测结果显示,20 ng/ml TNF-α刺激2 h后可引起磷酸化Ezrin蛋白向细胞周边定位和丝状肌动蛋白（filamentous actin,F-actin）重组,引起磷酸化Ezrin蛋白表达水平的增加。TNF-α处理后大鼠PMVECs通透性明显增加。Ezrin shRNA可部分逆转TNF-α诱导的磷酸化Ezrin蛋白向细胞周边定位和F-actin重组,减少磷酸化Ezrin蛋白表达水平,减轻TNF-α诱导的内皮高通透性。Ezrin蛋白本身的分布和表达水平对TNF-α刺激均无反应。4.EzrinT567A抑制TNF-α诱导的内皮反应TNF-α刺激后PMVCEs通透性明显增加,予EzrinT567A转染后,TNF-α诱导的PMVCEs通透性显著降低。5.TNF-α通过RhoA信号通路调控Ezrin蛋白磷酸化及内皮通透性通过RhoA抑制剂C3转移酶和RhoA shRNA两种手段检测RhoA的作用。与单纯TNF-α刺激组相比,C3转移酶+TNF-α组的磷酸化Ezrin蛋白周边定位和F-actin重组明显减轻,Ezrin蛋白磷酸化水平及内皮通透性均降低。再通过RhoA shRNA处理后发现,RhoA shRNA+TNF-α组也能明显抑制TNF-α诱导的Ezrin蛋白磷酸化变化,保护内皮屏障。6.TNF-α通过FAK信号通路调控Ezrin蛋白磷酸化及内皮通透性FAK在TNF-α诱导的内皮反应中的作用也通过FAK抑制剂PF-573228和FAK shRNA两种方法检验。PF-573228+TNF-α组可部分逆转TNF-α诱导的磷酸化Ezrin蛋白分布和表达水平,减轻TNF-α诱导的内皮高通透性。7.TNF-α诱导PMVECs内皮反应中,FAK是RhoA的上游信号RhoA shRNA预处理后,再予TNF-α刺激后,其p-FAK水平较单独TNF-α刺激组无变化,说明RhoA shRNA不能抑制TNF-α诱导的FAK的活化。反之,用FAK shRNA预处理PMVECs,再予TNF-α诱导后,其RhoA-GTP水平较TNF-α刺激组明显降低,与基线水平相当（p>0.05）,说明FAK是RhoA的上游信号。结论1.TNF-α可诱导大鼠PMVCEs Ezrin蛋白磷酸化和通透性增加。2.磷酸化Ezrin蛋白参与TNF-α诱导的大鼠PMVCEs内皮高通透性的调控。3.TNF-α通过RhoA、FAK信号通路诱导PMVCEs Ezrin蛋白磷酸化和内皮高通透性。4.在TNF-α诱导PMVCEs Ezrin蛋白磷酸化和内皮高通透性反应中,FAK是RhoA的上游信号。