鸡马立克氏病(Marek’s disease, MD)是以淋巴组织增生、外周神经麻痹和脏器、肌肉、皮肤肿瘤为特征的肿瘤性传染病,严重危害世界养禽业的发展。马立克氏病病毒(MDV)在流行过程中,已经从温和型病毒株演进化为强毒株,并出现了超强毒株。常规疫苗对强毒的免疫保护效果并不理想,对超强毒株免疫保护更是不尽人意。科学家利用各种方法构建MDV候选疫苗,特别是利用基因工程研发重组疫苗成为当前研究的热点及突破点。目前有已经分离到多株自然整合有禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)的马立克氏病病毒。最近研究表明REV的LTR可能赋予这种重组病毒某种选择性优势,LTR较强的启动子和增强子作用不仅能增强亲本病毒复制,而且不改变亲本病毒毒力,从而提高疫苗免疫力,这一优势为利用LTR改良马立克疫苗提供了保障。前期用MDV (JM/102W株)和REV(CSC株)混合感染鸭成纤维细胞(DEF),随后将细胞悬浮液接种于鸡,在鸡的羽毛囊内分离到一株含有LTR的重组马立克氏病病毒,并将该病毒中的LTR的基因片段连接到含有马立克氏病毒同源臂载体B40中,构建了带有LTR的供体穿梭质粒,并与CVI988/Rispens病毒基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),在细胞中进行同源重组,产生整合有LTR的CVI988/Rispens重组马立克氏病病毒(rMDV-LTR)。本研究对rMDV-LTR进行生物安全评价和免疫效力试验,期望得到免疫保护作用好而又安全的重组马立克氏病毒活疫苗,开发一种能作为表达保护性抗原基因的活疫苗载体。1含REV-LTR基因的重组马立克氏病毒生物学特性及感染与排毒检测将重组MDV分别通过鸡胚成纤维细胞(CEF)和SPF鸡的连续传代增殖,通过PCR法鉴定LTR基因是否插入,以及确定LTR在IRS和TRS的存在,进一步用测序的方法评价重组病毒插入基因的稳定性。在1日龄SPF鸡皮下接种重组MDV,通过非免疫同居鸡的羽囊和血液进行病毒分离、PCR检测等评估重组病毒水平传播能力。对1日龄鸡接种重组MDV后,通过对饲料、饮水、粪便、垫料等的病毒分离、PCR检测评估疫苗毒株在环境中的存活能力,通过对免疫鸡的组织病毒分离、PCR检测等评估重组病毒在免疫鸡体内的分布情况。试验结果表明重组马立克氏病病毒在CEF生长良好,以50.60 PFU/ml的病毒滴度感染CEF细胞,生长曲线结果表明,rMDV-LTR在培养前3 d空斑较少,在4 d空斑开始增加,在第5 d生长速度迅速加快,可持续增长到7 d。相比CVI988/Rispens母本株,在第2 d开始出现空斑,从第3 d开始匀速生长到第6 d生长达到高峰,随着病毒的传代病毒的繁殖能力不会改变。PCR及测序表明,插入片段LTR基因在传代病毒中稳定存在,且没有基因突变和缺失。重组马立克氏病毒经SPF鸡体内传代5代后,剖检没有明显肉眼病变,内脏组织结构清晰,没有明显病理变化。重组MDV接种1日龄SPF鸡,同时以母本株CVI988/Rispens做对照,非免疫同居鸡的组织病毒分离和PCR检测结果表明,重组马立克氏病毒具备向同居非免疫鸡进行水平传播的能力。排毒检测试验未从饲料、粪便、饮水及棉拭子中分离到病毒,因此重组病毒和CVI988/Rispens具有同样的安全性。2含REV-LTR基因的重组马立克氏病毒免疫效力研究将1日龄SPF鸡分成8组,每组20只,皮下免疫0.2 mL的重组MDV,剂量分别为500 PFU/只、750 PFU/只、1000 PFU/只、2000 PFU/只和3000PFU/只,同时CVI988/Rispens母本株2000 PFU/只和3000 PFU/只(0.2 mL)作为阳性对照,PBS 0.2 mL作为阴性对照。接种10天后,各组分别以500 PFU/只(0.2 mL)的剂量接种vv MDV rMd5.攻毒后的每天跟踪记录各组有无临床症状或死亡情况。饲养60天后,全部扑杀并剖检观察其病变。采集疑似MDV病变的组织、脏器,然后每组随机选取5只分别取其组织、脏器做石蜡切片,HE染色,进行病理组织学观察,最后疫苗免疫效力由保护指数来评价。试验结果表明攻毒对照各组死亡率为85%,其余各组精神、采食和饮水正常,内脏组织器官和组织切片的检查均未发现病理变化。因此,重组MDV与母本毒株具有相同的免疫保护效力。3含REV-LTR基因的重组马立克氏病毒对靶动物、非靶动物的安全性评价将含REV-LTR基因的重组MDV、母本病毒CVI988/Rispens与PBS作对照,分别通过皮下注射途径对1日龄敏感雏鸡进行一次单剂量、单剂量重复和一次大剂量免疫的安全性试验,对1日龄雏鸭和1日龄雏鹅最大剂量免疫试验,通过腿部肌肉注射途径对4周龄小鼠进行最大剂量免疫试验。疫苗免疫后,通过对试验动物的临床观察、生产性能测定、内脏组织器官变化和组织切片检查,评估重组MDV的安全性。试验结果表明,试验鸡、鸭、鹅和小鼠疫苗接种后,各组精神、采食、饮水正常,内脏组织器官和组织切片的检查均未发现病理变化。综上所述,重组MDV对靶动物、非靶动物具有良好的安全性。