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骨骼肌的分化发育是一个精细的网络调控过程,有多种功能性分子参与其中。Long non-coding RNA(lnc RNA)是一类调控多种生物学功能的非编码RNA,在癌症和肿瘤组织中被广泛的研究。目前针对影响肌肉分化发育的lnc RNA研究已有初步进展,但仍有大量lnc RNA有待挖掘。本研究以高通量芯片技术为主要研究策略,结合差异表达的lncRNA和mRNA,鉴定出两个受Myo D因子调控并影响肌细胞分化的lncRNA,主要研究结果如下:1.利用MyoD特异的siRNA转染C2C12细胞,待细胞分化2天后收集RNA和蛋白质,采用Q-PCR和Western Blotting技术检测敲低效率,同时检测调控上游/下游基因表达,发现MyoG、MyHC表达量随着MyoD基因干扰显著下降,上游基因无变化。利用lncRNA和mRNA芯片筛选了敲低MyoD后差异表达的lncRNA和mRNA,得到642个下调表达和335个上调表达的lncRNA。通过相关性分析,找出与这些差异变化lnc RNA相关的差异mRNA,利用软件对这些mRNA进行GO和KEGG分析,发现这些基因大都富集在与肌肉生成或肌肉运动相关的通路中。2.从基因芯片结果中筛选了37个表达量高且芯片差异倍数大的lncRNA,在小鼠13个组织中研究了基因表达情况。结果显示,9个lncRNA(MM9LINCRNAEXON11961-、AK141672、AK031663、ENSMUST00000150337、AK017263、ENSMUST00000154720、AK160312、AK163925、ENSMUST00000104935)在肌肉组织中高表达,AV570737等8个lnc RNAs在睾丸组织高表达,AK139402等4个lnc RNAs在脑中高表达,AK052777等7个lnc RNAs在肝、肾中高表达,AK143003等9个lnc RNAs广谱表达。3.从肌肉高表达和广谱表达的lncRNAs中筛选9个进一步分析。构建Myo D超表达载体反向验证9个候选lncRNAs的表达,发现AK143003、AK017263、ENSMUST00000150337的表达发生显著变化。分析了这3个lnc RNAs在不同分化时间的表达情况,发现它们的表达量均在分化初期显著上升,AK143003高表达能够一直维持到分化末期,而AK017263和ENSMUST00000150337在分化末期表达降低。4.鉴定分析了AK017263的基因序列,发现它是一个位于基因间的lnc RNA,且转录起始位点有Myo D、Myo G的结合。利用RACE技术得到了AK017263的全长序列,并对其编码能力进行预测,证明AK017263是一个非编码RNA。核质分离实验说明AK017263不论在细胞增殖期还是分化期,均存在于细胞核中。利用特异的siRNA降低AK017263的表达,Q-PCR、Western Blotting检测结果表明分化标志基因Myo G和MyHC表达量显著下降,证明AK017263可促进成肌细胞分化。5.鉴定分析AK143003的序列,发现它位于基因间,在它的转录位点上游有一个编码基因Mxd4。Northern、RACE和体外翻译实验证明了AK143003是一个单拷贝的非编码RNA。利用核质分离实验,鉴定出AK143003在细胞增殖期核质均有分布,细胞分化期则全部转移到细胞质中。利用特异的siRNA和构建成功的超表达载体对AK143003在肌细胞的功能进行分析,Q-PCR、Western Blotting、免疫荧光检测Myo G和MyHC的表达,发现降低AK143003的表达可以促进细胞分化,而增加AK143003的表达抑制细胞分化。另外,降低AK143003的表达,其邻近基因Mxd4表达升高,反之降低。这说明AK143003可能通过降低Mxd4的表达负调控肌肉分化。但Mxd4对肌肉分化的作用还未有人研究。鉴于此,利用真核表达载体和特异siRNA构建Mxd4过表达和抑制表达模型检测其对肌分化的影响。结果发现,降低Mxd4后,MyHC表达量降低,细胞分化受到抑制;超表达Mxd4,MyHC表达量增加,促进细胞分化。这个结果与最初的假设一致,说明Mxd4有可能是AK143003影响肌细胞分化的效应分子。本研究筛选出了37个与Myo D相关的lncRNAs,同时首次鉴定了AK017263和AK143003能够调控肌肉细胞分化,为lncRNA在肌肉分化网络中的作用提供新的证据,奠定了lncRNA在动物育种应用的理论基础。