菊花转录因子CmTGAs的克隆及同源遗传转化研究

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菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)是原产我国的传统花卉,集观赏、药用、食用于一体。在生产实践中,病害成为影响其产量和品质的重要因素,黑斑病是主要病害之一。水杨酸(SA)介导的系统获得抗性(SAR)能使植物获得对病原的广谱抗性,转录因子TGA在SA介导的SAR中起重要的调节作用。本研究以原产河南省焦作市怀区的优良品种小黄菊(Huaiqing yellow chrysanthemum)为试材,对其SAR调节基因CmTGAs进行了系统研究,并对其黑斑病原菌进行了分离纯化,取得了如下研究结果:1.分离到三个CmTGAs类基因全长,分别为CmTGA1、CmTGA5、CmPAN。采用Race法克隆到CmTGA1、CmTGA5、CmPAN三个基因,与已知基因序列进行同源性比对,同源性分别可达到61%,80%,65%,通过对编码区氨基酸序列进行分析发现,亮氨酸拉链保守区分别在N端第70-100、40-80、150-195个氨基酸,D亚族特征序列分别位于N端第340-351、309-321、420-430个氨基酸。2.构建了CmTGAs的过表达载体、获得了转化菌株。利用酶切、连接的方法构建了转基因载体super1300-GFP-CmTGAs,通过冻融法将super1300-GFP-CmTGAs导入农杆菌GV3101中。3.建立了小黄菊的胚状体高频再生及受体再生体系。最佳胚状体诱导培养基组合为MS+1.5mg/L IAA+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D,最适诱导时间为10d,诱导率可达80%,诱导后在去除2,4-D的分化培养基上,芽的分化率可达75%。以此为基础,进一步优化了受体再生体系,确定以5.0mg/L潮霉素(HmB)为芽分化选择压、4.5mg/L潮霉素为生根选择压、头孢霉素(Cef.)最适抑菌浓度为100mg/L。4.进行了CmTGA1的同源转化,获得了抗性植株。将小黄菊叶块在IM诱导培养基上预培养3d,用摇至OD600=0.5-0.7工程菌侵染10min,黑暗共培养2d,在含100mg/LCef.和1.0mg/L HmB的IM上,诱导5d转接到含100mg/L Cef.和5.0mg/L HmB的RM分生培养基筛选培养,待愈伤组织分化出不定芽后转到含100mg/L Cef.和10.0mg/LHmB DM发育培养基上生长两周左右,转到含50mg/L Cef.和4.5mg/L HmB RTM生根培养基中进行生根筛选培养。共获得抗性植株23株,18株具有明显绿色荧光蛋白。5.利用组织分离纯化法分离得到两个小黄菊黑斑病病原菌菌株A1和A2。用组织分离法共获得3个菌株,柯赫氏法则鉴定其中2个菌株为黑斑病致病菌;通过形态观察和产孢表型观察判断A1和A2均为链格孢属真菌;通过ITS序列进化树分析,证实了为菊花黑斑病病原菌,为转化植株的抗病性生物学检测提供了病原基础。
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