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鸡球虫病（Coccidiosis）是一种原虫病,由寄生在鸡肠上皮细胞中的艾美耳球虫引起,严重损害了鸡的生长和饲料利用率,给鸡养殖业造成巨大的经济的损失,是世界上最严重的家禽寄生虫病之一。目前,该病的预防和治疗主要依靠化学药物和疫苗。然而,随着化学药物的广泛长期使用,导致耐药球虫菌株的出现,严重降低传统药物的治疗效果。使用弱毒疫苗预防球虫病又存在返毒和散毒的风险。因此,研制新型疫苗势在必行。基因工程疫苗具有稳定、安全、易制备等优点,通常将保护性抗原与分子佐剂一起用于免疫机体,以增强疫苗的免疫效果。乳酸菌被公认为安全级（GRAS,generally recognized as safe）微生物,并可作为传递特定保护性抗原的载体,将抗原基因以通过口服的方式递送到机体细胞内,从而引发局部或全身的免疫反应。E.tenella抑制蛋白（profilin）,可通过的聚合和解聚,影响寄生虫的运动、入侵及宿主的免疫应答,具有较好的免疫原性,可以作为球虫疫苗的新靶点。鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白（FliC）是Toll样受体5的天然配体,能够辅助诱导抗原特异性反应来对抗病原体感染。本研究以pSIP-409-pgs A’表面锚定表达载体、以profilin为保护性抗原,以FliC作为佐剂构建重组植物乳杆菌,并评价重组菌的抗球虫免疫保护效果。主要研究内容及结果如下:通过PCR扩增profilin和profilin-FliC基因片段,并分别连接至锚定表达载体pSIP409-pgs A’上,双酶切和测序鉴定结果表明重组质粒pSIP409-pgs A’-profilin-FliC和pSIP409-pgs A’-profilin构建成功。将获得的共锚定表达质粒分别电转化NC8感受态细胞,经抗性筛选后得到重组乳酸菌NC8-pSIP409-pgs A’-profilin-FliC和NC8-pSIP409-pgs A’-profilin。Western blot和间接免疫荧光检测到profilin和profilin-FliC蛋白的成功表达并锚定于细菌壁表面,具有良好的反应原性。健康的1日龄雏鸡,随机分为六组,每组20只,分别为:PBS组、PBS-challenge（challenge）组、空载体NC8-pSIP409-pgs A’（409p’）、NC8-pSIP409-pgs A’-profilin-FliC组（profilin-FliC）、NC8-pSIP409-pgs A’-profilin组（profilin）、商品化抗球虫活疫苗组（Vaccine）。分别于3、4、5、17、18、19日龄进行口服免疫,每只免疫1×10~9CFU/200μL。在30日龄时接种E.tenella孢子化卵囊5×10~4个/只。在攻虫前,使用ELISA方法检测肠道内容物中分泌型抗体SIgA、血清中特异性抗体IgG含量,使用荧光定量法检测脾细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4转录水平。在攻虫前后,分别使用CCK-8法检测脾细胞增殖能力;流式细胞术检测脾中CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴细胞的水平;ELISA试剂盒检测血清中细胞因子IFN-γ、IL-2含量。在攻虫后,计算并分析相对增重率、卵囊排出量和盲肠损伤计分等保护性指标。ELISA结果显示共表达profilin-FliC基因组与单表达profilin基因组检测到的特异性IgG显著高于Challenge组（P＜0.001、P＜0.05）和409p’组（P＜0.001、P＜0.05）,profilin-FliC组显著高于profilin组（P＜0.05）;重组乳酸菌的特异性SIgA水平也显著高于Challenge组和409p’组（P＜0.001、P＜0.01）,profilin-FliC组显著高于profilin组（P＜0.01）;血清中细胞因子检测,在攻虫前后Profilin-FliC基因组的IFN-γ含量显著高于Challenge组（P＜0.001）和409p’组（P＜0.01）,IL-2含量在攻虫前仅profilin-FliC显著高于Challenge组（P＜0.05）,而在攻虫后显著高于Challenge组和409p’组（P＜0.001、P＜0.01）,重组菌间无显著差异。脾淋巴细胞在Profilin蛋白刺激下,检测淋巴细胞的特异性增殖能力,profilin-FliC组的增殖能力要显著高于Challenge组（P＜0.001）,同时荧光定量结果显示:在特异性蛋白刺激下,profilin-FliC组的脾淋巴细胞中的IL-2、IL-4和IFN-γ的m RNA转录水平显著高于Challenge组（P＜0.001、P＜0.01）。由流式细胞术结果可知:免疫重组乳酸菌可提高雏鸡脾脏中CD4+CD8+T淋巴细胞的水平,攻虫前后profilin-FliC组较Challenge组和空载体409p’组相比淋巴细胞中CD4+CD8+水平含量显著升高（P＜0.001、P＜0.01）。攻虫后,发现免疫重组乳酸菌可提高攻虫后鸡体重,增重率显著高于challenge（P＜0.001）,同时也高于vaccine组（P＜0.01）,其中profilin-FliC组相对增重率最高为82%。profilin-FliC组、Profilin组、Vaccine组雏鸡粪便中卵囊排出量明显减少,其相对于PBS组雏鸡卵囊减少率分别为42%、54%、75%。病理组织切片结果显示:口服免疫重组菌组肠道病理损伤明显减轻,卵囊、肠绒毛损伤、出血点和炎性细胞明显减少。Vaccine、profilin、profilin-FliC组ACI指数分别为149、136和160。结果表明口服含有共表达profilin-FliC蛋白的重组乳酸菌疫苗的具有良好的抗球虫效果。综上所述,本研究利用pgs A’将蛋白成功锚定表达于植物乳杆菌NC8表面,构建了表达Profilin蛋白和FliC佐剂蛋白的重组乳酸菌。重组菌可刺激机体特异性抗体IgG和s IgA的产生,提高抗球虫细胞和体液免疫水平,对球虫感染具有良好的免疫保护效果,为鸡球虫病的免疫防治提供了新策略。同时也发现了Flic蛋白能有效的增强重组疫苗的抗球虫免疫反应,证明了其可以作为粘膜疫苗佐剂的潜力。