水稻是我国主要的粮食作物,其种植面积约占全国耕地面积的1/4,年产量约占全国粮食总产量的一半。然而,水稻病害一直严重影响着水稻的生产,同时还影响稻米的品质和商品价值。稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的水稻稻瘟病(rice blast)是水稻上一种毁灭性的真菌病害,也是威胁世界粮食安全的主要病害,每年造成的粮食损失能够养活超过六千万人口。目前对于稻瘟病的防治主要采用选育抗病丰产优质良种为中心,科学栽培措施和化学保护为辅的综合治理措施。但是,由于稻瘟病菌在大田中易发生变异,抗病品种在种植3～5年后就降低或彻底丧失抗性,且化学防治所使用的药剂较为单一,主要为三环唑类药物。因此,进一步探索稻瘟病菌致病的分子机制有助于开发新的杀菌剂靶标,以更好的控制稻瘟病的危害。本论文主要对稻瘟病菌胞内信号传导途径的相关蛋白在稻瘟病菌生长发育以及致病过程中的功能和各信号通路之间的协调互作进行系统研究。细胞壁是丝状真菌抵御外界胁迫的第一道屏障,也参与细胞与外界的信号传导和物质交换,对维持细胞形态具有重要作用。前期工作中发现在稻瘟病菌中,一个高亲和性的磷酸二酯酶MoPdeH不仅参与胞内cAMP信号通路的调控,还能调节细胞壁完整性(Cell Wall Integrity,CWI)及致病力,但是对于其调控CWI的具体机制并不清楚。本文通过蛋白质免疫共沉淀的方法,筛选到一个与MoPdeH相互作用的蛋白激酶MoMck1,它是控制稻瘟病菌细胞壁完整性通路的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径中的一个关键蛋白。过表达MoMCK1可以部分的抑制AMopdeH突变体在菌丝自溶以及致病力方面的缺陷,说明MoPdeH可以通过CWI相关的MAPK途径调控细胞壁完整性。进一步发现,CWI通路的三个关键蛋白MoMck1,MoMkk1以及MoMps1都可以通过调控MoPDEH的表达量反馈调节胞内的cAMP水平。同时,通过对MoMkk1蛋白功能的研究,进一步完善了细胞壁完整性相关的MAPK通路:发现MoMkk1参与调控稻瘟病菌的气生菌丝形态建成、无性繁殖以及致病力。另外,MoMkk1还介导了细胞壁完整性通路与渗透压胁迫通路(HOG1-MAPK)、未折叠蛋白反应(UPR)途径间的交又对话。以上结果表明,MoPdeH作用在MoMck1-MoMkk1-MoMps1这条细胞壁完整性通路的上游,并且将稻瘟病菌中的cAMP通路、细胞壁完整性通路、渗透压胁迫通路以及未折叠蛋白反应途径联系起来,共同完成对外界环境胁迫的应答。细胞壁的形成很大程度依赖于在内质网中加工并向菌丝顶端运输的细胞壁组分蛋白,同时稻瘟病菌侵染水稻早期也需合成并分泌大量的效应蛋白干扰寄主的免疫反应,促进病菌的侵染。上述蛋白质大量合成时,常因蛋白质错误折叠而滞留在内质网中造成胁迫,病菌需激活下游的未折叠蛋白反应适应此胁迫。本文研究发现,内质网压力胁迫(DTT)可以激活CWI和细胞自噬,并且使MoAtg1激酶复合体结合到MoMkk1上,代替MoMck1激活MoMkk1-MoMps1磷酸化。实验发现,缺失CWI组分会影响细胞自噬进程;同时,过表达MoAtg1复合体组分可以完全互补缺失MoMCK1造成的缺陷,说明CWI与细胞自噬存在交叉对话关系。另外,过表达MoAtg1复合体的组分可以一定程度上增强稻瘟病菌在中抗水稻品种K23上的致病力,暗示着CWI与细胞自噬过程协同作用在稻瘟病菌侵染过程中具有重要作用。这些结果揭示了 CWI与细胞自噬过程存在交叉对话,阐明了在内质网胁迫下,病菌协调细胞自噬与CWI途径维持其正常生长发育和致病力的分子机制。RGS蛋白是生物体内cAMP途径的重要负调控因子,可以加速G蛋白α亚基自身的GTP水解酶活性,促使Gα亚基重新与Gβγ二聚体重新聚合成异三聚体,从而关闭cAMP途径。实验室前期研究结果表明,稻瘟病菌(M.oryzae)中含有8个RGS以及RGS-like蛋白(MoRgs1～8),它们共同或单独的调控病菌的生长、分化及致病力。在这些RGS蛋白中,MoRgs7十分独特,除了具有保守的RGS功能域外,在N端还存在一个7次跨膜结构;MoRgs7在病菌附着胞形成的初期定位于芽管中高度动态的囊泡状结构(晚期内含体)中,并随着附着胞的成熟而逐渐被降解,这暗示着MoRgs7在激活信号通路过程中可能存在着作用。另外,通过co-IP方法鉴定到一个MoRgs7的互作蛋白MoMip11(Magnaporthe oryzae Mip11),它是Gib2/RACK1/Asc1的同源蛋白。除了 MoRgs7外,MoMip11还选择性的与cAMP通路中多个调节因子相互作用,包括Gα亚基MoMagA,磷酸二酯酶MoPdeH。进一步的研究发现,MoMip11可以帮助激活MoMagA,并抑制MoPdeH的酶活性,同时可以干扰MoRgs7与激活态Gα的互作,从而综合的正调控胞内的cAMP水平。研究还发现MoMip1 1对于病菌响应多种外界环境胁迫都至关重要。总的来说,这部分我们发现了支架蛋白MoMip11与RGS蛋白互作并调控胞内的cAMP通路、胁迫应答以及致病力的一种新机制,凸显了多方面的调节网络在稻瘟病菌的生长、发育及致病过程中所发挥的重要作用。综上所述,稻瘟病菌中MAPK介导的细胞壁完整性通路通过协调cAMP通路、未折叠蛋白反应途径以及细胞自噬过程,共同调控稻瘟病菌的生长分化以及致病力。