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目的通过构建BRAF V600E真核细胞表达载体并转染人胰腺癌细胞系Panc-1,探讨BRAF V600E对人胰腺癌细胞系Panc-1生物学行为的影响,为研究胰腺癌的发病机制与治疗提供理论依据。方法采用脂质体法将重组的pCMV-Myc/BRAFV600E质粒(突变型BRAF基因)转染人胰腺癌细胞系Panc-1,通过G418筛选出BRAF V600E的阳性细胞克隆,并用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹(Western blot)的方法加以验证,同时以转染pCMV-Myc/BRAFW(野生型BRAF基因)的Panc-1细胞作为阴性对照,以转染空载体的Panc-1细胞作为空白对照;三组细胞分别在置于含G418、10%FBS的DMEM培养液中,并向其中加入2 mM谷胺酰氨以及青霉素、链霉素使其浓度为100U /mL,于37℃、5% CO2的培养箱中培养。MTT实验:每组约2,000细胞接种96孔细胞培养板上,在37℃、5%CO2的培养箱中培养。分别与0h、24h、48h和72h取出细胞,每孔加10μL MTT染液,在37℃、5% CO2的培养箱中培养4 h后离心,再加入二甲基亚砜150μL/孔。置于酶联免疫检测仪(Elx-800型)下测定波长570nm时的光密度(OD)值,比较三组细胞的生长情况。流式细胞计量术分析:每组约1×106细胞接种于50mL的培养瓶中,先加入100μLRNA酶A,然后对细胞进行PI染色,37℃、5% CO2孵育细胞30min,用流式细胞计量术分析细胞凋亡情况。迁移试验:每组约1×105细胞接种于Transwell小室的上室(100μL含G418、10%FBS的DMEM培养液);Transwell小室的下室加入600μL含G418、10%FBS的DMEM培养液;然后将上室置于下室中,在37℃、5%CO2条件下孵育6h;取出上室,用棉签拭去残留在滤膜上室表面的残留细胞,经PBS清洗后用4%多聚甲醛固定,蒸馏水洗涤,HE染色,显微镜(200×)下计数迁移到滤膜下室表面的细胞。侵袭试验:将Matrigel置于Transwell小室的上室滤膜上,37℃条件下孵育30min,