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毒死蜱是一种在农业上广泛被使用的有机磷杀虫剂，已导致了各地农业害虫抗药性的增加。谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione S-Transferases，GST)是一种二相解毒酶，它能降解毒死蜱或毒死蜱P450的氧化产物为低毒或无毒的产物，并能抗由毒死蜱引起的细胞氧胁迫，从而参与昆虫的抗药性。但是，毒死蜱诱导GST表达调控的机制仍不清楚。本论文以重要农业害虫斜纹夜蛾为研究对象，研究毒死蜱诱导SlGSTs表达的调控途径，以阐明毒死蜱是如何通过诱导斜纹夜蛾GST的表达而促进抗性的发展。研究结果如下： (1)芳香烃受体AHR(Aryl hydrocarbon receptor)的克隆与表达 根据几种昆虫基因组中AHR序列的同源性，用RT-PCR与Race方法，以毒死蜱诱导的斜纹夜蛾cDNA为模版，克隆获得了斜纹夜蛾全长cDNA，它包含了HLH、PAS-A和PAS-B等AHR基因特有的结构域，它的序列与其他昆虫AHR相似度非常高；用SWISS-MODEL软件对SlAHR的与配体结合的PAS-B区进行建模，结果显示它能形成一个袋状的结构，并且通过SydylX-1.1软件能够把这个袋状结构和毒死蜱对接。以包含PAS-A、PAS-B等结构域的SlAHR进行体外表达，获得了大小为80.29kD的蛋白，并制备了多克隆抗体。同时构建了AHR的RNAi实验载体，为研究AHR的作用做好了准备。 (2)氧胁迫受体Nrf2(NF-E2-related factor 2)的克隆与分析 根据几种昆虫基因组中Nrf2序列的同源性，用RT-PCR与Race方法，以毒死蜱诱导的斜纹夜蛾cDNA为模版，获得了2211bp长的全长cDNA，共编码447个氨基酸，蛋白分子量为50.9kD，等电点为8.73。同时构建了Nrf2的蛋白表达载体和RNAi实验载体，为研究Nrf2的作用做好了准备。 (3)SlGSTs启动子克隆与分析 分别克隆获得了SlGSTe1和SlGSTe3长度为844bp、1889bp启动子片段。通过生物信息学分析，SlGSTe1和SlGSTe3上均存在调控元件XRE、ARE和AP-1，并且每种相同调控元件的核心两侧序列、排列方向和所处位置都不一样。 (4)毒死蜱诱导SlGSTe3表达调控途径研究 无论在虫体或是细胞株中，毒死蜱都显著诱导SlGSTe3的表达增加。分别用10um和100um的毒死蜱的P450氧化产物CPO(Chlorpyrifos oxon)处理斜纹夜蛾细胞株，SlGSTe3的表达没有变化；SlGSTe3启动子活性测定也表明，CPO不作用SlGSTe3的启动子，说明毒死蜱诱导SlGSTe3表达不经P450。 但是毒死蜱显著作用于SlGSTe3启动子的XRE2和XRE3两个元件，其中XRE2是SlGSTe3主要的应答元件，而XRE1不参与作用。用AHR抗体进行染色体免疫共沉淀(ChIP)的实验。结果表明，抗原蛋白SlAHR能与SlGSTe3启动子上的XRE2和XRE3元件相互结合，证明毒死蜱-AHR-XRE-GST是SlGSTe3表达的主要途径。 (5)毒死蜱诱导SlGSTe1表达途径的研究 10uM和100uM的毒死蜱或CPO都能够诱导SlGSTe1的表达显著上调。用10uMCPO对SlGSTe1的约900bp长的启动子片段进行启动子活性检测，结果表明，SlGSTe1启动子上的AP-1元件片段对基因本底表达起作用，并且应答CPO的诱导。说明毒死蜱-P450-CPO-GST是毒死蜱诱导SlGSTe1表达的途径之一。结合SlGSTe1和SlGSTe3的表达途径，同时也说明了斜纹夜蛾中的GSTs应答毒死蜱的途径不尽相同。