花生疮痂病Elsino?arachidis(Bitanc.&Jenkins)Rossman&Allen近年来在辽宁省大规模流行,严重威胁着花生产业健康持续发展。花生疮痂病菌分离困难,在人工培养条件下生长缓慢且不易产生分生孢子,对该菌的后续研究造成了一定阻碍,因此,本文对该菌的生物学特性、产孢方法及侵染过程进行了研究,旨在为花生疮痂病的防控技术奠定理论基础。1.花生疮痂病菌生物学特性研究为明确花生疮痂病菌的生物学特性,本文对不同环境条件下该菌的菌丝生长和孢子萌发进行了系统研究。结果表明:花生疮痂病菌在人工培养基上生长缓慢,在PDA上菌落肉质,褶皱,菌株LN-SY-A01、LN-FT-A01和LN-JB-C01在PDA上生长30d菌落直径分别仅为26.37mm、26.43mm和27.07mm。菌株在PDA上LN-SY-A01和LN-FT-A01菌株的最适培养基为PDA、PSA和OA,LN-JB-C01菌株在PDA和PSA上生长状况良好,LN-SY-A01和LN-FT-A01菌株的最适碳源为甘露醇,LN-JB-C01的最适碳源为半乳糖,3株菌的最适氮源均为酵母精粉,最适温度为25℃,pH4~6时菌丝长势良好,黑暗有利于LN-JB-C01的菌丝生长,但对其他菌株无影响,菌丝致死温度为48℃10min;分生孢子萌发最适pH值为5,最适温度为25℃,最适碳源为1%葡萄糖,最适氮源为1%丙氨酸和1%甘氨酸,光照对分生孢子萌发影响不显著,分生孢子致死温度为47℃10min。2.花生疮痂病菌产孢方法筛选为诱导花生疮痂病菌产生分生孢子以便后续研究,本文设计了7种诱导花生疮痂病菌产孢的试验。研究结果表明,该菌能够利用菌丝涂布法、Fries液体培养法和菌饼靠接法中的谷类培养基成功产生分生孢子,各种方法均有其不同的特点。利用菌饼靠接法产孢最为简单,产生的分生孢子活力较高,分生孢子成熟度不均一,能够同时观察到孢子的不同阶段及产孢结构,偶尔观察到分生孢子双胞化。但利用此方法所产生的分生孢子较为黏着,不易与培养基和菌丝分离,无法获得孢子悬浮液,该方法可用于病原菌鉴定;利用菌丝涂布法所产生的分生孢子成熟度较均一,且能够获得孢子悬浮液,易于计数产孢量,可用于定量接种等实验。但产生的孢子量较少,每菌落仅为2×10~4个,因此,该产孢方法还有待进一步优化;利用Fries法所产生的分生孢子量最大,但成功率极低且不稳定,是否产孢及产孢量均具有偶然性,且多数情况下均产生厚垣孢子,因此,该方法的具体产孢条件有待进一步研究。3.花生疮痂病菌产孢条件优化为建立一套稳定快速的花生疮痂病菌分生孢子产生方法以进行该菌后续关于致病性、流行学和分子遗传学的研究,本文通过优化涂布法建立了一套简单有效的产孢方法。结果表明,将菌悬液涂布于pH为7的PDA上,确保菌落密度小于5个/cm~2,并在25℃黑暗条件下进行预培养5-7d,再将菌落夹碎至载玻片上水滴培养14h,最适宜该病原菌产孢,菌株LN-FT-A01的最大产孢量为8×10~4个。供试20个分离株均可利用此方法产生分生孢子,且菌株间的产孢能力差异显著,产孢量从0.7×10~4到2.3×10~5不等。利用此法所产生的分生孢子可成功侵染活体和离体花生叶片,使叶片产生典型的花生疮痂病症状。并证明了随着PDA中痂囊腔菌素(ESC)含量的增加,分生孢子产量减少,ESC含量达到0.6μg/ml时几乎没有产生分生孢子,ESC含量达6μg/ml时,菌落生长被完全抑制,说明可见光可通过使花生疮痂病菌菌丝产生红色的痂囊腔菌素(ESC)来抑制分生孢子的形成。4.花生疮痂病菌侵染过程研究为探究花生疮痂病菌的侵染过程,本文明确了利用孢悬液接种离体花生叶片的最适条件,并利用光学显微镜、扫描电子显微镜和透射电子显微镜较为系统的研究了花生疮痂病菌侵染花生叶片的发育过程、侵染过程、寄主症状变化及寄主细胞的病理学变化。试验结果表明,花生疮痂病菌孢悬液接种花生叶片的最适温度为25℃,湿度持续时间最短为4h即可接种成功。幼嫩花生叶片较老熟叶片更易接种成功,叶片1和叶片2在接种后60h即可发病,接种点发病率达90%以上,而叶片7在接种后120h才开始发病,接种点发病率33.3%。花生疮痂病菌分生孢子能够在花生叶片表面萌发出一个至多个芽管,并产生菌丝纵横扩展,随机分枝,分枝的芽管顶端产生类似附着胞和侵染钉的结构,且在类似侵染钉的结构上有粘液类物质分泌,推测粘液类物质可能是一种葡聚糖,其作用是使分生孢子能够更好的附着在叶片表面,并产生某种物质促进病原菌的侵染。接种后3d显微观察到菌丝直接穿透叶片侵入寄主的现象,与此同时,花生叶肉细胞遭到破坏,出现质壁分离现象,寄主抗性反应明显,花生叶片接种点处也开始出现病斑。