随着局部麻醉的广泛应用,局麻药的神经毒性损伤及全身毒性反应已引起人们的广泛关注。特别是局麻药所致的外周神经损伤,给病人生产生活带来明显不良影响。局麻药神经损伤的预防及其治疗成为临床麻醉中的重要课题。临床上,椎管内麻醉后,部分病人可出现短暂性神经病学综合征(transient neurological syndrome, TNS),表现为烧灼样、持续固定、痉挛性、放射性疼痛的症状。部分患者甚至可发生严重的神经功能永久性损害如马尾综合征。一般认为,局麻药所致的神经损伤与其剂量、浓度及脊神经在局麻药中暴露的时间呈正相关。但对于局麻药诱导的神经损伤机制目前尚不明确,可能与多种因素有关。细胞内钙超载是局麻药神经损伤的重要机制之一。细胞外Ca2＋可通过细胞膜上的电压依赖性与受体依赖性等Ca2＋通道进入细胞内,激活细胞内钙依赖性酶,诱导细胞凋亡,产生神经损伤。同时,进入细胞内的Ca2＋尚可诱发细胞内钙依赖性钙释放,使细胞内钙库释放大量Ca2＋,进一步加重细胞内钙超载,最终导致细胞凋亡,产生神经损伤。电压依赖性钙通道分为高电压依赖性钙通道(high voltage activated calcium channel, HAV)和低电压依赖性钙通道(low voltage activated calcium channel, LAV). Cav1和Cav2属于HAV,包括L型,N型,P/Q型和R型。低电压依赖性钙通道即T型钙通道则由Cav3编码,包括三种亚型(Cav3.1,Cav3.2, Cav3.3),其在静息电位下(-65mV～-50mV)即可激活,且具有快速激活,缓慢失活的特点；同时,T型钙通道还具有“窗口电流”,即在T型钙通道稳定激活曲线和稳定失活曲线之间有一相互重叠部分。HVA和LVA在慢性神经病理性疼痛中均有重要作用,与神经损伤有关。低电压依赖性钙通道即T型钙通道,是调节神经元兴奋性和神经递质分泌的重要启动子,也是调节细胞内钙信号的关键因素。目前关于T型钙通道在局麻药神经损伤中的作用尚不清楚。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinases,p38MAPK)激活是局麻药神经损伤的另一重要途径,细胞外Ca2＋进入细胞内,激活钙依赖的钙调蛋白酶(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase type Ⅱ, Ca2+/CaMK II),进‘步激活凋亡信号调节相关激酶1(Apoptosis signal-regulating kinase1,ASK1),诱导p38MAPK的激活,形成Ca2+/CaMKⅡ-ASK1-p38MAPK通路,p38MAPK的激活则可诱导神经细胞发生不依赖于半胱胺酸蛋白酶蛋白(Caspase)的凋亡反应。本课题采用SH-SY5Y细胞体外培养模型,通过免疫印迹和real-time PCR等方法,鉴定SH-SY5Y细胞表面T型钙通道各亚型的表达,并观察10mM盐酸利多卡因处理24h后,SH-SY5Y细胞表面T型钙通道的表达变化；采用RNAi技术,构建T型钙通道低表达的SH-SY5Y细胞株,并观察抑制SH-SY5Y细胞表面T型钙通道表达后,能否减轻利多卡因对该细胞的损伤作用,并检测p38MAPK的表达,探讨T型钙通道是否通过激活p38MAPK产生细胞毒性损伤作用。第1章盐酸利多卡因对SH-SY5Y细胞表面Cav3.1表达的影响实验1T型钙通道在SH-SY5Y细胞上的表达目的通过免疫印迹和real-time PCR方法检测T型钙通道各亚型(Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3) mRNA和蛋白质在SH-SY5Y细胞上的表达,鉴定SH-SY5Y细胞表面T型钙通道表达亚型。方法SH-SY5Y细胞体外培养,采用免疫印迹技术和real-time PCR技术,检测Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3在SH-SY5Y细胞上的表达。将免疫印迹X胶片扫描,采用quantity one图像分析软件分析目标条带的吸光度值,以β-actin条带吸光度值为参照,两者比值为目标蛋白的表达水平。real-time PCR定量的方法以2-ΔΔCt(Ct代表循环阈值)表示基因的表达量,计算公式为ΔΔCt=[Ct(待测组目标基因)-Ct (β-actin)]-[Ct(对照组目标基因)-Ct (β-actin)]。统计学处理采用SPSS10.0统计学软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(χ-±s)表示,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),多重比较采用LSD法,方差不齐时则分别采用Welch法和Dunnett’ s T3法,P<0.05为差异有统计学意义。结果免疫印迹法检测发现,在SH-SY5Y细胞上T型钙通道的三种亚型Cav3.1、 Cav3.2及Cav3.3蛋白均有表达,但表达量差异有统计学意义(F=777.113,P=0.000). Cav3.1蛋白在SH-SY5Y细胞上表达最丰富,而Cav3.2及Cav3.3蛋白的表达水平比Cav3.1蛋白表达水平降低,尤以Cav3.2的表达量为最少。Cav3.1、 Cav3.2、Cav3.3mRNA在SH-SY5Y细胞上均有表达,但表达量不一,Cav3.1mRNA的表达量最多,Cav3.2表达量则最少(F=194898.000,P=0.000)。结论T型钙通道三种亚型Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3在SH-SY5Y细胞上均有表达,但以Ca,,3.1表达为主。实验2盐酸利多卡因对SH-SY5Y细胞Cav3.1表达的影响目的Cav3.1是SH-SY5Y细胞上表达最为丰富的T型钙通道亚型,因此,SH-SY5Y细胞上低电压依赖性钙通道的生理学特征主要由Cav3.1通道体现,本研究的目的是观察SH-SY5Y细胞在盐酸利多卡因处理24h后其表面Cav3.1表达的变化。方法SH-SY5Y细胞离体培养,分为两组,一组正常培养,另一组细胞则用10mM盐酸利多卡因处理24h后,采用免疫印迹和real-time PCR方法检测Cav3.1的表达变化。将免疫印迹X胶片扫描,采用quantity one图像分析软件分析目标条带的吸光度值,以β-actin条带吸光度值为参照,两者比值为目标蛋白的表达水平。real-time PCR定量的方法以2-ΔΔCt (Ct代表循环阈值)表示基因的表达量,计算公式为ΔΔCt=[Ct(待测组目标基因)-Ct (β-actin)]-[Ct(对照组目标基因)-Ct (β-actin)]。统计学处理采用SPSS10.0统计学软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(χ-±s)表示,Cav3.1mRNA及蛋白表达采用配对t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果与对照组比较,10mM盐酸利多卡因处理组Cav3.1蛋白表达量增加,两组比较有统计学意义(t=9.932, P=0.000); Cav3.1mRNA表达量也增加,两组比较有统计学意义(t=12.573,p=0.000)。结论10mM盐酸利多卡因处理SH-SY5Y细胞24h后,细胞表面Cav3.1蛋白及mRNA表达增加。第2章pshRNA-CACNA1G-SH-SY5Y细胞株的构建与鉴定目的T型钙通道目前尚无特异性强的抑制剂,这成为阻碍T型钙通道研究进展的重要原因。随着基因干扰和基因工程技术的发展,靶向干扰目的基因的表达成为当前研究的重要工具,本研究的目的是通过RNAi技术,靶向干扰CACNA1G(Cav3.1基因),构建pshRNA-CACNA1G-SH-SY5Y细胞,以达到抑制Cav3.1基因和蛋白质的表达,为后续研究提供实验模型。方法根据RNAi设计原则和Genbank上Cav3.1(CACNAIG)基因序列(序列号NM018896),选择3个干扰靶点,同时设计一个阴性序列。选择pSUPERretro-puro为载体,经退火、酶切、连接、转化等步骤,所得产物测序鉴定；同时大提质粒,293FT细胞、慢病毒包装、收集病毒液,并将病毒转染到SH-SY5Y细胞,经免疫印迹和real-time PCR鉴定,构建pshRNA-CACNA1G-SH-SY5Y细胞株。Cav3.1蛋白及基因表达以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),多重比较采用LSD法,方差不齐时则分别采用Welch法和Dunnett’s T3法,P<0.05为差异有统计学意义。结果经DNA测序,三个干扰序列和阴性序列均顺利插入pSUPERretro-puro质粒中。免疫印迹和real-time PCR鉴定结果表明,三个干扰序列RNAi1、RNAi2、 RNAi3均能明显抑制pshRNA-CACNA1G-SH-SY5Y细胞上CACNA1G基因(Cav3.1)的表达,尤其以RNAi2转染效率最高,而阴性序列则对Cav3.1表达则无影响。结论经免疫印迹和real-time PCR鉴定,成功构建pshRNA-CACNA1G-SH-SY5Y(RNAi2)细胞株,为后续实验提供细胞模型。第3章盐酸利多卡因对pshRNA-CACNA1G-SH-SY5Y (RNAi2)细胞的影响目的通过上述实验,我们建立了Cav3.1低表达的pshRNA-CACNA1G-SH-SY5Y (RNAi2)细胞株,为探讨Cav3.1钙通道在盐酸利多卡因致神经细胞损伤中的作用提供实验模型。本实验目的是观察10mM盐酸利多卡因对Cav3.1低表达的pshRNA-CACNA1G-SH-SY5Y (RNAi2)细胞的影响,探讨Cav3.1在盐酸利多卡因致神经细胞损伤中的作用。方法细胞共分为6组,即对照组分别为SH-SY5Y组,pNC-puro-CACNAIG-SH-SY5Y(阴性序列组,NC组),pshRNA-CACNA1G-SH-SY5Y (RNAi2)组(RNAi2组)；实验组则为上述三组分别用终浓度为10mM盐酸利多卡因处理24h,即SH-SY5Y+利多卡因组(SH-SY5Y+Lido组),阴性序列+利多卡因组(NC+Lido组),RNAi2+利多卡因组(RNAi2+Lido组)。药物处理24h后在倒置显微镜下观察细胞形态；MTT法检测细胞存活率；流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞内Ca2+浓度([Ca2+]free);免疫印迹法检测Cav3.1蛋白及Caspase-3蛋白表达；统计学处理采用SPSS10.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(χ-±s)表示,细胞存活率、细胞凋亡率、Cav3.1蛋白及Caspase-3蛋白表达及[Ca2+]free采用两因素析因设计方差分析,单独效应分析时组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),多重比较采用LSD法,方差不齐时则分别采用Welch法和Dunnett’s T3法,P<0.05为差异有统计学意义。结果(1)细胞形态倒置显微镜下观察各组细胞形态学变化,见图3-1。三个对照组即SH-SY5Y组、NC组、RNAi2组细胞生长情况良好,细胞呈梭型,突起丰富,细胞呈网状生长。实验组分别为SH-SY5Y+Lido组、NC+Lido组和RNAi2+Lido组,SH-SY5Y+Lido组、NC+Lido组细胞蜷缩,突起消失,细胞漂浮；RNAi2+Lido组细胞虽也表现为部分细胞漂浮,胞体蜷缩,但仍然观察到部分细胞突起,部分细胞形态完整。(2)细胞活力MTT法检测细胞经盐酸利多卡因处理24h后细胞活力,对照组细胞活力分别为(100.0±0.0)%,(98.3±5.9)%,(96.5±5.9)%；而SH-SY5Y+Lido组、NC+Lido组及RNAi2+Lido组细胞活力明显降低,分别为(50.0±2.4)%,(50.6±6.6)%,(65.2±3.0)%。经析因方差分析,结果显示利多卡因处理因素各组间差异有统计学意义(F=798.768,P=0.000),基因序列的插入因素各组间差异有统计学意义(F=7.141,P=0.003),利多卡因处理因素及基因序列插入因素间有交互作用(F=14.896,P=0.000)。进一步分析单独效应,结果显示在固定非利多卡因处理因素时,基因序列插入因素各水平条件下均无统计学意义(F=0.829,P=0.456),在固定利多卡因处理因素下,SH-SY5Y+Lido组和NC+Lido组及RNAi2+Lido组间差异有统计学意义(F=22.267,P=0.000)。固定无基因序列插入时,SH-SY5Y组与SH-SY5Y+Lido组比较差异有统计学意义(F=2500.000,P=0.000)。固定有阴性序列插入时,NC组与NC+Lido组比较差异有统计学意义(F=175.377,P=0.000),固定有干扰序列插入时,RNAi2组与RNAi2+Lido组计较差异有统计学意义(F=142.746,P=0.000),见表3-1,图3-2。(3)细胞凋亡率三个对照组细胞凋亡率分别为(7.0±1.4)%、(6.7±1.0)%、(6.8±1.5)%,各对照组间比较差异无统计学意义；10mM盐酸利多卡因处理24h后,SH-SY5Y+Lido组和NC+Lido组细胞凋亡率分别为(61.5±2.7)%、(61.7±2.7)%,10mM盐酸利多卡因处理RNAi2组细胞后细胞凋亡率为(46.5±5.2)%。经析因方差分析,结果显示利多卡因处理因素各组间差异有统计学意义(F=2871.057,P=0.000),插入基因序列因素各组间差异有统计学意义(F=29.358,P=0.000),利多卡因处理因素及基因序列插入因素间有交互效应(F=29.380,P=0.000)。进一步分析单独效应,结果显示在固定非利多卡因处理因素时,基因序列插入因素各水平条件下差异均无统计学意义(F=0.096,P=0.909),在固定利多卡因处理因素下,SH-SY5Y+Lido组和NC+Lido组及RNAi2+Lido组间差异有统计学意义(F=33.082,P=0.000)。固定无基因序列插入时,SH-SY5Y组与SH-SY5Y+Lido组比较差异有统计学意义(F=1875.947,P=0.000)。固定有阴性序列插入时,NC组与NC+Lido组比较差异有统计学意义(F=2231.557,P=0.000),固定有干扰序列插入时,RNAi2组与RNAi2+Lido组计较差异有统计学意义(F’-327.044,P-0.000),见表3-2,图3-3。(4)Cav3.1的表达SH-SY5Y组细胞Cav3.1表达与NC组细胞表达无统计学意义,但RNAi2组细胞Cav3.1表达减少,10mM盐酸利多卡因处理24h后,SH-SY5Y+Lido组细胞和NC+Lido组细胞Cav3.1表达增加,RNAi2+Lido组细胞Ca,,3.1表达比三个对照组均有增加,但与SH-SY5Y+Lido组细胞和NC+Lido组细胞比较,其增加的幅度降低,见图3-4。统计学分析表明,插入基因序列主效应有统计学意义(F=93.860,P=0.005),利多卡因处理效应也有统计学意义(F=973.876,P=0.000),但RNA干扰与利多卡因处理这两个因素之间无交互效应(F=2.042,P=0.147),见表3-3。(5) Caspase-3的表达三个对照组细胞活化的Caspase-3(Cleaved-caspase-3)表达较低,而非活化的Caspase-3(Procaspase-3)的表达较多,三个对照组间比较差异无统计学意义(F=0.304,P=0.742)；与此相反,10mmM盐酸利多卡因处理24h后,三个实验组活化的Cleaved-caspase-3表达增加,而非活化的Procaspase-3表达则减少。统计学分析表明,对Procaspase-3及Cleaved-caspase-3的表达,利多卡因处理因素主效应有统计学意义(F=1150.570,P=0.000和F=582.441P=0.000),插入基因序列因素主效应也有统计学意义(F=91.081,P=0.000和F=32.372,P=0.000),利多卡因处理与基因序列插入这两个因素之间有交互效应(F=92.318,P=0.000和F=33.529,P=0.000)。单独效应分析表明,固定无利多卡因处理因素时,SH-SY5Y组、NC组、RNAi2组procaspase-3和cleavedcaspase-3表达差异无统计学意义(F=0.304,P=0.742和F=0.932,P=0.416)。固定利多卡因处理因素时,SH-SY5Y+Lido组、NC+Lido组、RNAi2+Lido组procaspase-3和cleavedcaspase-3表达差异有统计学意义(F=227.787,P=0.000和F=57.604,P=0.000)。固定无基因序列插入时,SH-SY5Y组与SH-SY5Y+Lido组比较差异有统计学意义(F=672.256,P=0.000和F=216.216,P=0.000)。固定有阴性序列插入时,NC组与NC+Lido组比较差异有统计学意义(F=671.226,P=0.000和F=415.059,P=0.000),固定有干扰序列插入时,RNAi2组与RNAi2+Lido组比较差异有统计学意义(F=672.256,P=0.000和F=216.216,P=0.000)见表3-4,3-5。(6)[Ca2+]free三个对照组细胞内[Ca2+]free分别为(417±13)nM、(413±16) nM、(408±15)nM。各对照组间比较无统计学差异；10mM盐酸利多卡因处理24h后,SH-SY5Y+Lido组和NC+Lido组细胞[Ca+]free分别为(608±15) nM、(607±13) nM,10mM盐酸利多卡因处理RNAi2组细胞[Ca2+]free为(520±12)nM。经析因方差分析,结果显示利多卡因处理因素各组间差异有显著性(F=1217.976,P=0.000),插入基因序列因素各组间差异有统计学意义(F=43.549,P=0.000),利多卡因处理因素及基因序列插入因素间有交互效应(F=32.035,P=0.000)。进一步分析单独效应,结果显示在固定非利多卡因处理因素时,基因序列插入因素各水平条件下均无显著性(F=0.514,P=0.608),在固定利多卡因处理因素下,SH-SY5Y+Lido组和NC+Lido组及RNAi2+Lido组间差异有统计学意义(F=81.695,P=0.000)。固定无基因序列插入时,SH-SY5Y组与SH-SY5Y+Lido组比较差异有统计学意义(F=538.156,P=0.000)。固定有阴性序列插入时,NC组与NC+Lido组比较差异有统计学意义(F=503.833,P=0.000),固定有干扰序列插入时,RNAi2组与RNAi2+Lido组计较差异有统计学意义(F=207.950,P=0.000),见表3-6,图3-6。结论10mM盐酸利多卡因处理24h后,SH-SY5Y组、NC组及RNAi2组细胞Cav3.1表达增加,但RNAi2组表达增加幅度低于SH-SY5Y组和NC组细胞。经盐酸利多卡因处理后,各组细胞形态学发生改变,细胞活力降低、细胞凋亡增加、Caspase-3表达增加,[Ca2+]free增加；但RNAi2组细胞损伤的程度低于SH-SY5Y组和NC组细胞,提示盐酸利多卡因对pshRNA-CACNA1G-SH-SY5Y (RNAi2)细胞的损伤作用减轻。第4章Cav3.1钙通道通过p38MAPK通路致SH-SY5Y细胞损伤目的观察10mM盐酸利多卡因处理pshRNA-CACNA1G-SH-SY5Y (RNAi2)细胞24h后,p38MAPK表达情况,探讨抑制Cav3.1表达在盐酸利多卡因对SH-SY5Y细胞损伤中的保护作用是否通过抑制p38MAPK激活途径,为盐酸利多卡因神经损伤的防治提供理论依据。方法细胞共分为6组,即对照组分别为SH-SY5Y组,阴性序列NC组(pNC-puro-CACNA1G-SH-SY5Y), RNAi2组[pshRNA-CACNA1G-SH-SY5Y (RNAi2)]组；实验组则为上述三组分别用终浓度为10mM盐酸利多卡因处理24h,即SH-SY5Y+利多卡因组(SH-SY5Y+Lido组),阴性序列NC±利多卡因组(NC+Lido组),RNAi2+利多卡因组(RNAi3+Lido组)。药物处理24h后在倒置显微镜下观察细胞形态；MTT法检测细胞存活率；流式细胞仪检测细胞凋亡率；免疫印迹法检测p38和p-p38MAPK蛋白的表达；统计学处理采用SPSS10.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(i±s)表示,细胞存活率、细胞凋亡率、p38和p-p38MAPK蛋白表达采用两因素析因设计方差分析,单独效应分析时组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),多重比较采用LSD法,方差不齐时则分别采用Welch法和Dunnett’s T3法,P<0.05为差异有统计学意义。结果细胞形态、细胞活力、细胞凋亡率及细胞凋亡情况同第3章实验结果。各组p38MAPK表达比较差异无统计学意义,主效应(F=0.071,P=0.791和F=0.061,P=0.941)及二者之间的交互效应(F=0.363,P=0.699)均无统计学意义。对p-p38MAPK表达的影响,盐酸利多卡因处理因素主效应(F=911.349,P=0.000)和插入序列因素主效应(F=53.082,P=0.000)及二者之间的交互效应(F=49.737,P=0.000)均有统计学意义。单独效应分析表明,固定非利多卡因处理因素时,插入基因序列对p-p38表达无影响(F=0.145,P=0.866)。固定利多卡因处理因素时,SH-SY5Y+Lido组、NC+Lido组及RNAi2+Lido组p-p38MAPK表达比较差异有统计学意义(F=59.673,P=0.000)。固定无基因序列插入时,SH-SY5Y组与SH-SY5Y+Lido组比较差异有统计学意义(F=264.266,P=0.000)。固定有阴性序列插入时,NC组与NC+Lido组比较差异有统计学意义(F=520.990,P=0.000),固定有干扰序列插入时,RNAi2组与RNAi2+Lido组计较差异有统计学意义(F=278.400,P=0.000)见图4-1,表4-1,4-2。结论pshRNA-CACNA1G-SH-SY5Y (RNAi2)细胞靶向抑制Cav3.1表达后,10mM盐酸利多卡因对其损伤作用减轻,且这种减轻作用可能与p-p38MAPK表达减少有关。