溃疡性结肠炎(UC)是一种主要累及直肠、结肠粘膜的慢性非特异性炎症,临床上至今没有特异性的根治措施,治疗多以抗炎、调节免疫为主。近年研究发现,肠道受到一系列损伤发生溃疡后,机体的修复机制开始启动来促进其快速愈合,其过程有许多生长因子参与。肠三叶因子(ITF)是一种由杯状细胞分泌的特异分布于肠道的新型细胞生长因子,具有很强的细胞保护作用,可明显减轻多种损伤因子介导的肠粘膜损害,它不仅具有一般生长因子所具有的促进细胞增殖与移行能力,还具有独特的生理功能并可同粘液糖蛋白结合,稳定肠粘液层。因此,ITF被认为是肠道的特异保护因子。中医药在UC的治疗上有着明显的优势,开展中药对ITF调节作用的深入研究,有望为UC的治疗提供新的契机。脾胃研究所在多年临床经验的基础上,以清热健脾活血为治则,总结出治疗UC的溃结灵复方(KD),临床取得了较好的疗效。前期研究采用三硝基苯磺酸法(TNBS)制作UC大鼠模型,发现KD能明显减少UC大鼠结肠溃疡个数和面积,改善结肠粘膜炎症和水肿等病理变化,同时又能降低模型大鼠血清中促炎因子IL-1β、TNF-α的含量和结肠组织中NF-κBp65蛋白的阳性细胞率,对模型大鼠结肠粘膜TLR2、TLR4基因表达也有抑制作用。本研究拟从促粘膜修复入手,观察KD对ITF的表达及其信号转导通路的关键蛋白MEK、ERK磷酸化的影响,探讨KD治疗UC的深层次作用机理。这一研究将使中医药治疗UC的机理研究深入到基因调控水平,并为开发高质量的抗UC中药新药打下坚实的基础,有着重要的理论意义和广阔的应用前景。1 KD对UC大鼠结肠粘膜超微结构的影响研究发现UC病变主要限于结肠粘膜和粘膜下层,且以溃疡和炎症变化为主。髓过氧化物酶(MPO)是中性粒细胞中含量较高的一种酶,与炎症变化密切相关。本实验在我们前期病理形态学研究的基础上,进一步观察了KD对UC大鼠结肠粘膜的超微结构影响及MPO含量的改变,以期对其作用机制进行初步的探讨。大鼠随机分为4N:正常组、模型对照组、KD组和阳性药SASP组。治疗十天后处死大鼠并采集结肠组织标本。透射电镜观察,发现UC模型组大鼠结肠粘膜上皮表面的微绒毛脱落,变短,扭曲,细胞器减少,细胞质液化溶解,腺上皮细胞间连接松散,提示炎症及溃疡引起了上皮细胞及细胞连接的损伤。杯状细胞分泌增强,有的细胞内颗粒呈排空状态,可能是在受到炎性介质刺激下,肠道杯状细胞分泌量代偿性增加(包括粘蛋白、三叶因子等),从而启动肠粘膜自身保护机制。经溃结灵治疗后,大鼠结肠粘膜上皮表面的微绒毛基本完整,腺上皮间相互连接紧密,胞浆内粘液颗粒较丰富,并向腺腔排出,表明溃结灵能够减轻结肠粘膜超微结构损伤,促进杯状细胞分泌保护因子,进而加快肠道粘膜重建和溃疡修复过程。MPO检测结果显示,模型组大鼠结肠粘膜MPO活性为0.3516±0.0738U/g,明显高于正常组0.1982±0.0719 U/g(P＜0.01);与模型组比较,溃结灵组和SASP组结肠MPO活性显著降低(分别为0.2876±0.0554 U/g,P＜0.05;0.2507±0.0303 U/g,P＜0.01),提示溃结灵能减轻TNBS大鼠的炎症程度,减少溃疡发生。2 KD对UC大鼠结肠粘膜ITF基因和蛋白表达的影响ITF被看作是粘膜损伤的快速反应肽,在胃肠道有两个重要功能,即上皮保护和促进粘膜愈合,与肠道炎症性疾病的发生和发展有着密切的关系。本研究观察KD对TNBS法大鼠模型结肠粘膜ITF基因及蛋白表达的作用,深入探讨其作用机制。大鼠随机分组同前,治疗十天后处死大鼠并快速采集结肠标本。选择结肠病变相同部位剪取小块组织,固定包埋切片,免疫组织化学染色,光镜下观察ITF蛋白表达情况,并进行半定量统计分析。余下粘膜用Trizol提取总RNA,RT-PCR法检测ITFmRNA的表达,以GAPDH作为内参,产物进行凝胶电泳分离,用凝胶成像仪自带分析软件进行灰度分析,以ITF与GAPDH的灰度值比值作为ITFmRNA的相对表达量,进行组间比较分析。结果显示,模型组结肠粘膜中ITFmRNA相对表达量为1.027±0.1263,略高于正常组(1.004±0.1046;P＞0.05);模型组结肠组织ITF蛋白表达与正常组比较无显著差异(P＞0.05)。溃结灵组和SASP组结肠粘膜中ITFmRNA相对表达分别为1.268±0.2113和1.299±0.3117,明显高于模型组(P＜0.05);溃结灵组和SASP组结肠组织中ITF蛋白表达也明显高于模型组(P＜0.01),提示KD对TNBS法UC大鼠模型结肠粘膜ITF基因及蛋白表达有明显上调作用,这可能是溃结灵治疗作用的一个关键靶位。3 KD对UC大鼠结肠粘膜MUC2基因表达的影响粘蛋白2(MUC2)也是杯状细胞合成的分泌型蛋白,是维持粘液层厚度及胶体形态的主要成分,在粘膜保护及肠道疾病修复机制中占有重要的地位。本研究观察了KD对TNBS法UC大鼠模型结肠粘膜MUC2mRNA表达的影响,并探讨其中的作用机理。分组和治疗同前述,治疗结束后,刮取结肠粘膜标本并提取总RNA,采用RT-PCR法检测MUC2mRNA的表达,以GAPDH作为内参,产物进行凝胶电泳分离,用凝胶成像仪自带分析软件进行灰度分析,以MUC2与GAPDH的灰度值比值作为MUC2mRNA的相对表达量,进行组间比较分析。结果显示,UC模型组大鼠结肠粘膜MUC2mRNA的相对表达与正常组比较,略有增高,但没有显著差异(分别为0.6423±0.1668和0.5924±0.1758,P＞0.05)。与模型组比较,溃结灵和SASP对UC大鼠结肠粘膜MUC2基因的表达都有明显的上调作用(分别为0.9811±0.1828和1.0491±0.2675,P＜0.01)。提示,KD能上调MUC2基因表达,从而加强肠道粘膜屏障的保护功能,促进受损区域上皮细胞重建,这可能是溃结灵治疗UC的作用机理之一。4 KD对UC大鼠结肠粘膜pERK1/2、pMEK1/2蛋白水平的影响Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2等MAPK信号转导通路是广泛存在于真核细胞内的一条重要信号转导通路,参与调节细胞的分化、增生、凋亡等过程。有研究发现生长因子等有丝分裂刺激因素是激活ERK途径的主要细胞外信号,被激活的ERK可诱导细胞产生增殖、分化等核反应。KD对TNBS法UC大鼠模型结肠粘膜ITF基因及蛋白的表达有明显的上调作用,在此基础上本研究对UC大鼠模型结肠粘膜ERK1/2、MEK1/2磷酸化水平进行检测,以期对KD治疗UC的较深层次的作用机理进行探讨。分组和治疗同前,治疗结束后采集结肠粘膜标本并提取全细胞蛋白,运用蛋白免疫印迹(Western blot)方法对pERK1/2、pMEK1/2的蛋白表达水平进行检测,以β-action作为内参,以目的蛋白与β-action的密度比值作为目的蛋白的相对含量,进行组间比较分析。结果显示,模型组大鼠结肠粘膜中pERK1/2、pMEK1/2蛋白相对表达量分别为0.3974±0.1017和0.6994±0.1372,均高于正常组(分别为0.2037±0.1234和0.4092±0.1177,P＞0.05,P＜0.01)。与模型对照组比较,KD组pERK1/2、pMEK1/2蛋白相对表达量明显增高,分别为0.7060±0.1607和0.8928±0.1801(P＜0.01,P＜0.05)。阳性药SASP组pERK1/2、pMEK1/2蛋白相对表达量为0.7299±0.2710和0.9053±0.1591,也显著高于模型组(P＜0.01,P＜0.05)。提示KD对TNBS法UC大鼠模型结肠粘膜pERK1/2、pMEK1/2蛋白表达有显著上调作用,这可能是其治疗UC的作用环节之一。5结论ITF具有很好的胃肠粘膜保护作用,在炎症性肠病时上调表达,可促进损伤粘膜的修复。其作用机制涉及ITF与粘糖蛋白相互作用,增强粘液凝胶层对粘膜表面有害物质的抵抗,以及促进细胞迁移增殖等。对ITF的深入研究,特别是对其在炎性肠病粘膜修复中作用的研究,颇具应用价值。本研究选用清热健脾活血中药复方KD治疗大鼠实验性UC,取得了较好的疗效,结果表明,①KD能明显降低UC模型大鼠结肠中MPO的活性,改善结肠粘膜的超微结构;②显著上调UC模型大鼠结肠粘膜中MUC2基因、ITF基因及蛋白的表达水平;③明显提高UC模型大鼠结肠粘膜中ERK1/2和MEK1/2磷酸化水平。综合研究结果分析,KD治疗UC的作用机制,一方面可能是通过上调ITF和MUC2的表达,加强二者相互作用,促进了粘液凝胶层的形成,进而增强肠道粘膜防御屏障的保护能力;另一方面,也可能是通过上调ITF表达从而激活ERK信号转导通路,刺激UC大鼠肠道上皮细胞移行增殖,加速损伤修复的。进一步,我们还需对ITF及MAPK信号传导通路在肠损伤中的作用作更为深入和全面的动态研究,明确其作用的分子机制及具体的靶基因和蛋白,以便为临床UC治疗提供新的思路与方法。