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尿酸(uric acid,UA)是人类嘌呤代谢的最终产物,与痛风相关。目前,许多证据将高尿酸与心血管疾病联系在一起。许多流行病学调查也发现尿酸与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的重要危险因素,是高血压、冠心病等心血管疾病的预测因子。但是某些队列研究的多因素分析并不支持这种结论。因此,高尿酸与心血管疾病的相关性尚不确切,这些争论促使我们进一步探索高尿酸与心血管疾病相互间的关系及机制。 基础研究方面,高尿酸血症导致血管损伤的病理生理机制尚未明确。有研究提示,高尿酸可通过过度激活肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)导致血管损伤,引起内皮细胞功能障碍。肾素(前体)受体[prorenin receptor,(P)RR]作为RAS较新的成员是否参与尿酸导致的血管损伤尚未有研究证实。 在AS形成的起始阶段,关键是血流动力学改变及外周血白细胞对血管内皮细胞的黏附、浸润作用。单核细胞在粘附、迁移中表现出比其他白细胞更强的变形能力。因此,深入研究内皮细胞对单核细胞粘附、迁移的影响,有助于理解动脉粥样硬化形成的机制,同时也能为临床的靶向治疗提供更为准确、高效的作用位点。 尿酸是否可以激活(P)RR致内皮功能紊乱、影响细胞粘附功能,导致AS的机制并不明确。微流控芯片技术是一种可控的用于模拟流体状态的装置,具有实时观察并模拟血流状态,调控流体变化,节省细胞资源等优点,对研究内皮细胞粘附功能具有重要的意义。由于单核细胞与内皮细胞的滚动粘附过程为持续动态变化的过程,为了更好地观察这一重要现象,验证尿酸导致内皮功能改变及粘附分子变化对单核细胞粘附的影响,我们拟通过微流控系统,在血流动力学状态下研究高尿酸血症对单核细胞与内皮细胞的影响,探讨高UA导致AS的相关机制。 目的: 本研究探讨了高尿酸对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)表达(P)RR及粘附功能的影响,以及通过微流控芯片技术进一步研究在血流动力学状态时,高尿酸对HUVECs的损伤影响并对其机制进行探讨。 方法: 1.提取原代HUVECs,采用不同时间点(0h、12h、24h、36h、48h)、不同浓度(0mg/dl、6mg/dl、9mg/dl、12mg/dl)的尿酸干预内皮细胞,测定(P)RR的表达。 2.选取最适时间点及浓度作为高尿酸水平干预HUVECs,检测(P)RR的表达及细胞间粘附分1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的表达及其影响机制,通过Transwell小室研究THP-1与内皮细胞粘附效应。 3.设计微流控芯片,建立相关血管流体数字模型,模拟低切应力(low shearstress,LSS)水平时HUVECs对(P)RR及ICAM-1表达的影响。 4.在微流控系统中,观察LSS及高尿酸刺激时,HUVECs表达(P)RR和粘附分子ICAM-1的变化,研究THP-1与内皮细胞间的粘附效应,探讨HUVECs在静态与流体培养中的功能差别。 结果: 1.与对照组(0mg/dl)相比,6mg/dl及12mg/dl尿酸组(P)RR的表达未见明显增加,9mg/dl尿酸组(P)RR的表达明显升高(P<0.05)。 2.用9mg/dl浓度的尿酸刺激HUVECs不同时间后,(P)RR的表达在12h开始升高,于24h达峰值(P<0.05),36h后开始下降,后逐渐降至对照组水平。选取尿酸浓度9mg/dl,刺激时间24h作为后续实验刺激条件。 3.与对照组(0mg/dl)相比,尿酸组(9mg/dl)(P)RR的表达明显升高(P<0.01),P-p38MAPK表达明显升高(P<0.05),粘附分子ICAM-1的表达也随之升高(P<0.05)。与尿酸组相比,加入丙磺舒抑制尿酸的吸收后,(P)RR的表达明显降低(P<0.05),同时P-p38MAPK的表达明显减少(P<0.05),粘附分子ICAM-1的表达也随之减少(P<0.05) 4.(P)RR siRNA组(P)RR的表达明显减少(P<0.05),同时ICAM-1及P-P38MAPK的表达被抑制(P<0.05)。 5.在Transwell小室中,HUVECs予以绿色荧光探针标记,THP-1予以细胞橙色荧光标记,与对照组相比,尿酸组THP-1粘附于HUVECs的数量明显增多(P<0.01)。 6.在微流控芯片直通道内,低切应力组(P)RR的表达(P<0.01)及ICAM-1的表达(P<0.05)较静态组升高更显著。 7.在微流控芯片直通道内,低切应力情况下,尿酸组与对照组相比,(P)RR的荧光强度(P<0.01)及ICAM-1的荧光强度(P<0.05)明显升高。 8.高尿酸(9mg/dl)可增加HUVECs对THP-1细胞的粘附性,较低的切应力可使THP-1细胞粘附数量进一步增加(P<0.01)。 结论: 1.HUVECs表达丰富的(P)RR。 2.尿酸刺激HUVECs表达(P)RR呈时间及剂量依赖性,在尿酸浓度为9mg/dL、刺激时间为24h时,(P)RR的表达最高 3.高尿酸能上调(P)RR表达,可能通过激活P38MAPK信号通路,引起ICAM-1表达增加,并使得THP-1与HUVECs的粘附数量增加。 4.在模拟血流动力学动态观察时,低切应力可以促使HUVECs表达(P)RR、ICAM-1增加。 5.在低切应力的情况下,高尿酸可增加(P)RR、ICAM-1的表达,引起HUVECs与THP-1细胞的粘附作用增强,并可能由此介导血管内皮损伤,进一步促进AS的发生。