哺乳动物授精是一个多步骤的复杂过程,包括很多独特的行为,有很多特异性蛋白或脂质等分子的参与。其中蛋白二硫键异构酶(PDI)家族成员Pdia3 (ERp57)和CRISP (cysteine-rich secretory proteins,CRISPs)家族蛋白参与了精卵融合,但是对于其介导精卵融合的分子机制尚不清楚。本实验克隆了绒山羊CRISPs家族各成员蛋白的cDNA序列,制备了小鼠抗羊CRISP2多克隆抗体,用免疫组织化学和免疫细胞化学技术研究了CRISP2蛋白在睾丸中的的表达定位,并用免疫共沉淀和酵母双杂交技术检测了绒山羊CRISP2和Pdia3在细胞内能否直接相互结合,以图解析CRISP2和Pdia3在精卵融合中的分子机制。实验首先设计保守性引物,采用RT-PCR方法成功克隆了绒山羊的CRISP1、CRISP2、CRISP3 cDNA(同时也克隆到了绵羊的CRISP2、CRISP3 cDNA)。克隆到的绒山羊CRISPs蛋白长度均在240 aa左右,均有20 aa左右长度的信号肽。将所得到的绒山羊和绵羊CRISPs氨基酸序列同GenBank和Ensembl数据库中公布的其它物种的CRISPs氨基酸序列进行比对,发现不同物种的CRISPs蛋白同源性较高,且有16个高度保守的半胱氨酸残基,成为该家族的特征。将克隆得到的绒山羊的CRISP1、CRISP2、CRISP3 cDNA去信号肽序列后,分别构建了pGEX-CRISP1、pGEX-CRISP2、pET44a-CRISP3原核表达载体,诱导表达出融合蛋白GST-CRISP1、GST-CRISP2、Nus-CRISP3。用纯化的GST-CRISP2融合蛋白作为免疫原免疫昆明(KM)小鼠,最后腹腔注射S180细胞,制备了小鼠抗绒山羊CRISP2的腹水多克隆抗体,并采用戊二醛交联法纯化了自制的腹水多抗体。Western blotting分析显示所制抗体能特异性识别组织中的CRISP2蛋白。免疫组织化学检测绒山羊睾丸组织发现CRISP2蛋白大量出现于睾丸曲精细管内侧中央区,即成熟精子出现的区域。免疫细胞化学检测精子细胞显示CRISP2蛋白位于精子头部的赤道区至顶体部位。本实验还构建了pcDNA-CRISP2和pcDNA-Pdia3真核表达载体,共转染Hela细胞,进行了免疫共沉淀实验分析。同时也构建了酵母双杂交载体pGAD-CRISP2与pGBK-Pdia3,进行了酵母双杂交实验。两实验结果均发现CRISP2与Pdia3在细胞内能够相互结合。