基于NF-κB与COX-2信号的艳山姜挥发油对LPS诱导血管内皮细胞损伤保护作用的实验研究

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自卡萨尼丝提出“人与动脉同寿”的观点,血管内皮细胞生理功能与病理的变化成为人类健康研究的热点之一。大量研究结果证实,心血管系统疾病的发生和发展与血管内皮细胞损伤密切相关,而炎症反应是内皮细胞损伤关键的病理机制。民族药艳山姜为姜科山姜属植物艳山姜Alpiniazerumbet(Pers.)Burtt et Smith的干燥成熟果实,贵州民间广泛用于心血管系统疾患的防治。实验室前期研究证实,挥发油(EOFAZ)是其主要药效部位之一,具有抗炎、改善血管内皮功能及氧化应激状态等药理作用。  目的:研究艳山姜挥发油(EOFAZ)对脂多糖(LPS)诱导的人主动脉内皮细胞(HAEC)损伤的保护作用,并进一步阐明其对NF-κB及COX-2信号的调控,为其临床应用提供实验基础与理论指导。  方法:本实验以传代培养4-5代的人主动脉内皮细胞(HAEC,ScienCell)为研究对象。观察不同浓度EOFAZ(低剂量:50ng/ml;高剂量:100ng/ml)对脂多糖(LPS,1μg/ml)诱导炎症损伤的保护作用,同时选取阿托伐他汀(Atv,5μM)、阿司匹林(Asp,2mM)作为阳性对照药。通过MTT法、LDH外露率、Giemsa染色和HE染色判断HAEC损伤;Tunel染色观察EOFAZ、Atv、Asp对LPS诱导HAEC凋亡的保护作用;RT-PCR检测EOFAZ、Atv、Asp对LPS诱导HAECICAM-1、COX2 mRNA表达的影响;蛋白免疫印迹法(Western blotting)分析EOFAZ、Atv、Asp对LPS诱导HAEC NF-κB激活及对COX-2表达的影响。  结果:MTT实验结果表明,LPS(1μg/ml)处理12h后OD值明显下降,而EOFAZ(50ng、100ng)、Atv(5μM)、Asp(2mM)干预后OD值明显升高;LDH外露率实验结果提示,LPS(1μg/ml)处理12h后,LDH外露率明显提高,各组药物干预后LDH外露率明显降低;tunel染结果表明,LPS(1μg/ml)处理12h后tunel染色阳性细胞数增加(细胞核呈黄褐色),苏木素复染后蓝紫色细胞明显减少,而各组药物干预后tunel染色阳性细胞明显减少。LPS(1μg/ml)可诱导HAEC ICAM-1、COX2 mRNA及蛋白表达上调;NF-κB p65磷酸化增加、IκBα降解增多。EOFAZ(50ng、100ng)、Atv(5μM)、Asp(2mM)对LPS诱导的HAEC损伤具有不同程度的保护作用:①各组药物干预后细胞活力增加、凋亡细胞减少;②各组药物干预后均可抑制ICAM-1 mRNA及蛋白的表达;③EOFAZ(50ng、100ng)、Asp(2mM)降低COX-2 mRNA及蛋白的表达;④EOFAZ(50ng、100ng)、Atv(5μM)、Asp(2mM)均抑制 NF-κB激活,稳定 IκBα,EOFAZ具有一定的剂量正相关性。  结论:LPS诱导HAEC损伤与NF-κB及COX-2信号密切相关;EOFAZ对LPS诱导的血管内皮细胞炎性损伤具有保护作用,其作用机制可能与稳定 IκB、抑制NF-κB p65磷酸化以及抑制COX2表达有关。
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