[目的]　　 启动子活性常通过观察报告基因(reporter gene)的表达来进行分析，而目前常用的荧光素酶(luciferase，Luc)基因和绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)基因都有各自的优点和局限性。本研究希望通过构建荧光素酶和绿色荧光蛋白融合表达(Luc-GFP)载体来综合两者的优势，为启动子活性的分析提供一种简便、高效、稳定和灵敏的检测方法。另外，启动子的活性受多种转录因子的调控，本研究运用生物信息学方法，通过对转录因子结合位点的分析预测获取奶牛β-酪蛋白基因(casein beta，CSN2)的潜在增强子序列，并通过将潜在增强子序列与β酪蛋白启动子一道构建报告基因表达的重组载体而分它对β酪蛋白启动子活性的影响，期望获得乳腺组织特异性的增强子，为奶牛乳腺生物反应器的构建或优化创造条件。　　 [方法]　　 通过质粒的双向环状PCR定点突变，将pGL3-Basic载体上原有的XbaⅠ识别序列替换成PstⅠ识别序列。应用重叠延伸PCR(gene splicing by overlapextension PCR，SOE-PCR)将萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，FL)基因(luc+)、6×his标签(his tag)序列和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescentprotein，EGFP)基因(eGFP)拼接成融合基因(luc+6×his-eGFP)，将融合基因定向插入到含有不同β-酪蛋白基因启动子的重组载体中，构建成荧光素酶和绿色荧光蛋白融合的表达载体。另外，将luc+替换成eGFP，构建成以eGFP为报告基因的报告载体。通过三种不同报告基因的检测方法检测β-酪蛋白基因启动子的活性。通过ensembl数据库查找奶牛β-酪蛋白基因上游-3000bp左右的非翻译序列，通过三种转录因子结合位点的在线预测分析工具分析CSN2上游-3177bp～-1609bp区的转录因子结合位点，筛选最可能含有增强子的潜在增强子序列。将潜在增强子序列插入到β-酪蛋白基因启动子上游，构建成含有潜在增强子的重组增强子载体，通过双荧光素酶报告系统检测，分析潜在增强子的功能。　　 [结果]　　 (1)成功将萤火虫萤光素酶报告载体pGL3-Basic中的XbaⅠ酶切识别位点替换成PstⅠ位点而获得不含XbaⅠ酶切识别位点的萤火虫萤光素酶报告载体pGL3-PstⅠ-Basic、rp1-pGL3-PstⅠ-Basic、rp2-pGL3-PstⅠ-Basic、rp3-pGL3-PstⅠ-Basic、rp4-pGL3-PstⅠ-Basic、rp5-pGL3-PstⅠ-Basic、rp6-pGL3-PstⅠ-Basic和op0-pGL3-PstⅠ-Basic；　　 (2)运用重叠PCR技术成功地拼接了融合基因luc+-6×his-eGFP，构建了含不同重组β-酪蛋白启动子引导的融合基因表达载体pGL3-Luc-6×His-EGFP-Basic、rp1-pGL3-Luc-6×His-EGFP-Basice、rp2-pGL3-Luc-6×His-EGFP-Basice、rp3-pGL3-Luc-6×His-EGFP-Basic、rp4-pGL3-Luc-6×His-EGFP-Basic、rp5-pGL3-Luc-6×His-EGFP-Basic、rp6-pGL3-Luc×His-EGFP-Basic和op0-pGL3-Luc-6×His-EGFP-Basic；　　 (3)成功的构建了以eGFP基因为报告基因的表达载体pGL3-EGFP-Basic、rp1-pGL3-EGFP-Basic、rp2-pGL3-EGFP-Basic、rp3-pGL3-EGFP-Basic、rp4-pGL3-EGFP-Basic、rp5-pGL3-EGFP-Basic、rp6-pGL3-EGFP-Basic和op0-pGL3-EGFP-Basic；　　 (4)以双荧光素酶报告系统及绿色荧光蛋白基因报告载体对6种重组β-酪蛋白启动子引导荧光素酶或绿色荧光蛋白基因表达的活性进行分析测定，结果显示重组β-酪蛋白启动子rp1的表达效能最高，其引导荧光素酶表达的活性是原始β-酪蛋白启动子op0活性的160％。　　 (5)查找了奶牛β-酪蛋白基因转录起始位点上游-3000bp左右的调控序列，采用三种转录因子结合位点的在线预测工具对-3177～-1609区进行增强子β-酪蛋白预测分析，最终筛选出-1885～1745区域内一段长141bp的序列为潜在增强子序列，并将其克隆至重组载体中β-酪蛋白启动子的上游，构建成重组增强子载体Enhancer-rp1-pGL3-Basic、Enhancer-rp2-pGL3-Basic、Enhancer-rp3-pGL3-Basic、Enhancer-rp4-pGL3-Basic、Enhancer-rp5-pGL3-Basic、Enhancer-rp6-pGL3-Basic和Enhancer-op0-pGL3-Basic。　　 (6)采用双萤光素酶报告系统对7种重组增强子载体的分析测定结果显示，插入潜在增强子序列后，所有重组增强子载体活性均比天然启动子载体(op0-pGL3-Basic)强，其中Enhancer-rp1-pGL3-Basic最强，其引导荧光素酶报告基因表达的活性约为原始β-酪蛋白启动子op-0(op0-pGL3-Basic)活性的180％。　　 (7)激素诱导分析活性最高的重组增强子载体Enhancer-rp1-pGL3-Basic。结果显示胰岛素起负调控作用；催乳素和皮质醇激素具有正调作用，最高可达空白对照的155％。　　 [结论]　　 成功构建了3种不同检测方式的报告基因的重组β-酪蛋白启动子系列载体，三种检测结果基本一致，均为含重组β-酪蛋白启动子rp1载体中的报告基因表达活性最高；重组β-酪蛋白启动子rp1引导的荧光素酶表达水平是天然β-酪蛋白启动子op0引导荧光素酶表达水平的160％。成功将通过生物信息学预测获得141bp潜在增强子序列插入启动子上游，并使天然β-酪蛋白启动子op0引导荧光素酶报告基因表达的活性提高至180％。激素调控分析表明，皮质醇激素可以促进重组增强子载体Enhancer-rp1-pGL3-Basic表达，活性可以提高155％。