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研究背景叶黄素是一种植物来源的非维生素A含氧类胡萝卜素,具有包括抗炎症,抗氧化应激和抗肿瘤效应在内的多种生物学特性。乳腺癌等许多实体瘤的瘤体内常存在低氧微环境并且肿瘤低氧和坏死区常通过分泌促炎因子等一系列机制导致肿瘤细胞增殖、转移和血管生成。细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species ROS)的水平随着低氧发生而增加,并与线粒体代谢密切相关。低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)参与了内在和外部肿瘤相关炎症信号分子的活化,血管生成以及肿瘤侵袭。低氧条件下ROS可激活包括ERK和p38 MAPK在内的HIF-1α的上游信号分子。HIF-1α转运到核内与NOTCH直接作用并上调一系列NOTCH靶基因。转录因子发状分裂相关增强子1(hairy and enhancer of split,Hes1)是肿瘤细胞的一个关键转录因子,其表达上调与肿瘤发生、细胞分化、肿瘤恶性程度、肿瘤干细胞的成瘤性等相关。HES1可由经典和非经典通路激活。NOTCH通路是激活HES1的典型经典通路。由于HES1促进上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)的发生并且上皮间质转化被认为是促进肿瘤发生侵袭和转移的重要机制,所以HES1在肿瘤侵袭和转移中可能发挥重要作用。本研究的目的旨在揭示叶黄素对低氧环境中乳腺癌细胞增殖活性、侵袭和转移的干预效应及其活性氧产生和HES1上、下游信息分子的的表达状态等分子机制,为叶黄素用于乳腺癌的化学预防提供理论依据。方法1.低氧或常氧条件下用不同浓度叶黄素(5,10,20,40,80,和120μM)干预人乳腺癌MDA-MB-157和MCF-7细胞株24小时。0μM组叶黄素作为阴性对照。使用MTT实验检测细胞增殖能力并分析数据并分别计算叶黄素作用于乳腺癌细胞的IC50。2.在低氧或常氧条件下使用流式细胞术AnnexinV-FITC/Propidium iodide(PI)双染实验检测(0,20,40,和80μM)叶黄素处理的MDA-MB-157和MCF-7细胞的凋亡率。3.低氧条件下40μM的叶黄素处理或HES1表达载体转染MDA-MB-157和MCF-7细胞后,qRT-PCR和western blot检测细胞HIF-1α,NOTCH信号通路分子,HES1和上皮间质转化相关分子的mRNA和蛋白水平。4.低氧条件下40μM的叶黄素处理或HES1表达载体处理MDA-MB-157和MCF-7细胞后,transwell实验检测细胞侵袭能力。5.低氧条件下40μM的叶黄素处理或HES1表达载体处理MDA-MB-157和MCF-7细胞后,细胞划痕实验实验检测细胞转移能力。6.叶黄素,过氧化氢,N-乙酰半胱氨酸处理MDA-MB-157和MCF-7细胞后,使用流式细胞术DCFH-DA检测细胞内的活性氧水平。7.叶黄素,过氧化氢,N-乙酰半胱氨酸处理MDA-MB-157和MCF-7细胞后,western blot检测HIF-1α,NOTCH和HES1的mRNA和蛋白表达水平结果1.MTT检测显示低氧或常氧条件下与未处理叶黄素的细胞相比,叶黄素抑制MDA-MB-157和MCF-7细胞增殖的效应呈现剂量依赖性。2.流式细胞术分析表明:与低氧条件中未处理叶黄素的细胞相比,MDA-MB-157和MCF-7细胞的凋亡率随叶黄素浓度增加而增加。3.在MDA-MB-157和MCF-7细胞中,叶黄素抑制低氧诱导HIF-1α的活化,研究目的NOTCH信号通路分子mRNA和蛋白表达减少,HES1表达减少,并抑制低氧诱导的EMT相关分子的表达。叶黄素介导的EMT相关分子表达下调可被HES1过表达逆转。4.低氧条件下叶黄素显著抑制乳腺癌细胞侵袭能力,并且可被HES1过表达显著逆转。5.低氧条件下叶黄素显著抑制乳腺癌细胞迁移能力,并且可被HES1过表达显著逆转。6.低氧诱导ROS水平的升高可被叶黄素和N-乙酰半胱氨酸抑制,但可被过氧化氢促进。7.HIF-1α,NOTCH和HES1的表达也可被叶黄素和N乙酰半胱氨酸抑制,但可被过氧化氢增加。结论1.叶黄素显著抑制体外低氧条件下乳腺癌细胞的增殖,侵袭和转移。2.叶黄素显著抑制低氧导致的ROS水平升高,并通过抑制ROS降低HIF-1α的稳定性。3.叶黄素显著抑制体外低氧条件下乳腺癌细胞的增殖,侵袭和迁移能力的机制可能是通过HIF-1α和NOTCH信号通路介导HES1表达下调,进而抑制了EMT过程所实现的。