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背景FOXP3(Forkhead Box P3)是一种蛋白质编码基因,也被称为scurfin[1,2]。与FOXP3相关的疾病包括免疫调节[3-8],多内分泌疾病[9-14]和肠病[15-19],X连锁[20-30]和胰岛素依赖性糖尿病[31-39]。与FOXP3相关的主要通路是Th2的分化途径[40-45]和由PI3K介导的IL-2信号事件[46-49]。与此基因相关的功能主要包括转录因子活性和序列特异性DNA结合活性[50-52]。这个基因的重要旁系是FOXP4[53-56]。人类FOXP3基因含有11个编码外显子[57-59]。外显子-内含子边界在小鼠和人类基因的编码区域是相同的[60]。通过基因组序分析,FOXP3基因定位于X染色体的p臂(特别是Xp11.23)[61,62]。在来自乳腺癌[63-65],前列腺癌[66,67]和卵巢癌[68]患者的肿瘤标本中已经报道了FOXP3表达的下调,表明FOXP3是潜在的肿瘤抑制基因[69,70]。在衍生自其他癌症类型(包括胰腺癌,黑素瘤,肝癌,膀胱癌,甲状腺癌,宫颈癌)的肿瘤标本中也检测到FOXP3的表达[71-80]。然而,在这些报道中,没有分析相应的正常组织,因此尚不清楚FOXP3在这些肿瘤中是否为抗肿瘤分子。在前期的实验与工作中我们惊奇的发现与正常的胰腺组织相比,在胰腺导管腺癌中FOXP3的表达是升高的,而在正常胰腺组织中FOXP3的表达是缺失的或弱阳性。重要的是我们发现FOXP3高表达组患者术后复发转移率较低表达组明显增高,且两者间存在统计学差异。提示在胰腺癌中FOXP3高表达会促进胰腺癌细胞转移。因此,本课题旨在探讨FOXP3与肿瘤侵袭转移的关系,明确其潜在的调控机制。本课题中我们从细胞水平功能学水平、动物模型水平来明确FOXP3在胰腺癌侵袭转移中的重要作用。方法1.应用Western blot的方法检测正常胰腺导管上皮细胞HPDE6C7及多种胰腺癌细胞系FOXP3的基础表达水平,并在此基础上应用分子克隆方法构建FOXP3过表达质粒及FOXP3shRNA降表达质粒,构建慢病毒稳定转染系统,建立稳定转染细胞系;用Western blot检测所构建稳系表达FOXP3的水平。2.利用上述构建的细胞系进行划痕实验、transwell实验、I型胶原侵袭实验,利用活细胞工作站动态观察FOXP3表达水平对细胞迁移、侵袭运动能力的影响,运用免疫荧光F-actin染色来观察FOXP3的表达对细胞内部F-actin分布的影响。3.利用构建的PANC-1 pLKO-Control与PANC-1 pLKO-FOXP3的细胞系,将荧光素酶质粒导入这两细胞稳系中,于裸鼠体内进行胰腺原位成瘤实验,利用小鼠活体成像技术动态观察FOXP3的表达与胰腺癌细胞在裸鼠体内转移的情况。4.利用构建的PANC-1 pLV-Control与PANC-1 pLV-FOXP3的细胞系,提取这两细胞稳系的mRNA送RNA Sequence测序。联合RNA测序结果及TCGA数据库信息分析与FOXP3表达及侵袭转移功能相关的差异基因。利用RT-qPCR实验技术检测FOXP3的表达与筛选的差异基因在RNA水平的关系来进一步筛选与FOXP3表达最明显的差异基因。再次结合TCGA数据库检测FOXP3与上述筛选的最明显差异基因的关系。5.通过Western blot和免疫组织化学染色检测FOXP3与筛选的差异基因的关系。利用CHIP实验和双萤光素酶实验证实这两基因的调控关系。结果1.FOXP3在胰腺癌细胞中的表达水平及胰腺癌FOXP3细胞稳系的构建。根据不同胰腺导管腺癌细胞系FOXP3的基础表达水平,应用慢病毒感染技术成功构建FOXP3过表达的胰腺癌细胞系(AsPC-1和PANC-1)和FOXP3降表达的细胞系(PANC-1和MIA PaCa-2)。2.体外细胞功能学实验证明FOXP3的过表达能够促进胰腺癌细胞的迁移和侵袭。利用划痕实验发现上调FOXP3的表达能促进胰腺癌细胞的迁移;利用Transwell实验,发现上调FOXP3的表达能促进胰腺癌细胞系的迁移和侵袭,下调FOXP3的表达则起抑制作用;利用I型胶原侵袭实验及活细胞工作站技术平台发现上调FOXP3的表达能促进胰腺癌细胞系的向I型胶原的侵袭及迁移,下调FOXP3的表达则起抑制作用。F-actin免疫荧光染色发现,与对照组相比,上调FOXP3,细胞边缘呈现F-actin的极性分布,FOXP3上调越高,F-actin极性分布越明显。综合上述现象,提示FOXP3的表达上调与胰腺癌细胞的侵袭性增强呈正相关关系。3.小鼠胰腺原位成瘤实验证实FOXP3的表达下调抑制胰腺癌细胞的侵袭迁移。运用小鼠活体成像技术发现与对照组相比,干扰组小鼠胰腺瘤块与小鼠胰腺间界限清楚,似有包膜;而对照组瘤块则较明显地侵袭进入小鼠胰腺组织。且干扰组远处转移灶也明显较对照组少,而两组小鼠胰腺原位瘤块的大小和质量上是不具有统计学差异的。4.MMP19是与FOXP3侵袭迁移功能最相关的基因。PANC-1 pLV-Control与PANC-1 pLV-FOXP3两稳转细胞系RNA Sequence测序联合TCGA数据库信息分析出了与FOXP3表达及侵袭转移功能相关的数个差异基因。利用RT-qPCR实验技术检测FOXP3的表达与筛选的差异基因在RNA水平的关系,发现FOXP3的表达与MMP19的表达关系最明显。再次结合TCGA数据库信息确认了FOXP3与MMP19的mRNA水平存在明显的差异表达关系(r=0.336,p<0.001)。5.CHIP实验结合双荧光素酶实验验证FOXP3对MMP19的调控关系。用Western blot验证了FOXP3稳转细胞系中FOXP3和MMP19表达同升共降的关系,用组织化学染色确定了胰腺癌石蜡组织标本中FOXP3与MMP19表达的正相关关系(r=0.511,p<0.001)。生物信息学分析提示MMP19启动子区存在FOXP3转录结合的潜在靶向序列,进一步选取人源胰腺导管腺癌细胞系PANC-1应用染色质免疫共沉淀技术,验证转录因子FOXP3在MMP19启动子区的结合位点。进而构建MMP19启动子区报告基因载体,应用双荧光素酶报告基因实验证实,FOXP3可以直接结合并转录激活MMP19的表达,而突变上述FOXP3在MMP19启动子区的结合位点后,该转录活性显著受到抑制,证实了肿瘤细胞FOXP3可以直接调控胰腺癌细胞MMP19的表达。结论1.胰腺癌细胞中FOXP3的表达上调能促进胰腺癌的侵袭和转移。2.FOXP3能直接结合到MMP19启动子区的结合位点,调控MMP19的转录、翻译进而调节胰腺癌的侵袭和转移。