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肺孢子菌是一种机会致病性真菌,其感染多发生在免疫功能受损或缺陷的患者,如艾滋病、肿瘤、器官移植以及慢性阻塞性肺病等,严重者可导致死亡。因此,卡氏肺孢子菌感染早期准确、及时的诊断对临床治疗是十分重要的。近年发现,Th17细胞与感染性疾病有密切关系,其分泌的IL-17对念珠菌、肺孢子菌等真菌感染有一定的抵抗力;还发现IL-12和IL-23可促进IL-17分泌。然而,Th17细胞及细胞因子的免疫应答功能还不十分清楚。该研究通过构建大鼠感染卡氏肺孢子菌模型从两个方面开展研究:一是研究检测卡氏肺孢子菌的环介导恒温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP);二是在明确感染卡氏肺孢子菌的基础上,研究这些感染大鼠肺泡灌洗液、肺组织匀浆和体外培养巨噬细胞上清液中细胞因子IL-17、IL-23和IL-12表达水平的变化。用30只Wister雌性大鼠构建感染卡氏肺孢子菌的动物模型,14周后麻醉大鼠,固定并行气管插管,获取肺泡灌洗液,经离心、沉淀、悬浮后,分别置于24孔板内,37℃、5%的二氧化碳箱培养24h后,收集培养上清备用。取大鼠肺组织制备印片,采用常规姬氏染色检测卡氏肺孢子菌,其余肺组织贮存于-80℃备用。结果显示,感染卡氏肺孢子菌的大鼠肺组织印片经姬氏染色后,镜下可观察到卡氏肺孢子菌包囊,这表明实验感染动物模型构建成功,其感染率为75%。另取0.2g冻存的肺组织做匀浆,收集匀浆上清备用;其沉淀用裂解液和酚-氯仿法提取基因组,通过载体pGEX-6p2构建核内核糖体小亚基的重组质粒pGEX-6p2-18s rDNA和线粒体核糖体大亚基重组质粒pGEX-6p2-mtLSUrDNA,筛选阳性克隆并测序。结果显示,两个重组质粒pGEX-6p2-18srDNA和pGEX-6p2-mtLSU rDNA测序结果与Genbank序列一致。利用在线软件(primerexplorerV4)分别设计18s rDNA和mtLSU rDNA的特异性环介导扩增引物,以提取大鼠的基因组为模板,恒温63℃扩增1h,扩增产物用限制性内切酶酶切,观察酶切结果;同时采用重组质粒拷贝数倍比稀释法来测定LAMP的敏感性。研究结果显示,只有18srDNA引物进行环介导恒温扩增(LAMP)能扩增出梯状条带,且扩增产物的酶切片段大小与理论值相符。实验中用重组质粒拷贝数倍比稀释法检测其敏感性,结果不稳定,可能与目的基因多态性有关。采用PCR和巢氏PCR法分别对大鼠肺组织基因组样品进行检测,确定大鼠感染率。结果显示,巢氏PCR的敏感性高于病原学和PCR,其特异性低于病原学,存在一定的假阳性。在明确大鼠卡氏肺孢子菌感染的基础上,用ELISA法测定感染大鼠肺泡灌洗液、肺泡巨噬细胞培养上清和肺组织匀浆中的IL-17、IL-23和IL-12的浓度,并与对照组进行比较。结果发现,实验组中感染卡氏肺孢子菌的大鼠肺泡灌洗液中的IL-17、IL-23和IL-12浓度明显高于对照组,而非感染大鼠与对照组却无显著差异。综上所述,本实验成功构建了感染卡氏肺孢子菌的动物模型,采用病原学、PCR和巢氏PCR三种检测法确定大鼠感染率。使用基因重组技术合成重组质粒pGEX-6p2-18s rDNA和pGEX-6p2-mtLSU rDNA。18srDNA LAMP引物扩增出梯状条带,初步建立了检测卡氏肺孢子菌的LAMP方法;该方法简便快捷,反应时间短,但由于其稳定性较差,仍待进一步研究。用ELISA法定量三种样品中细胞因子的浓度,结果显示实验组中感染卡氏肺孢子菌大鼠肺泡灌洗液中的IL-17、IL-23和IL-12浓度显著增高,表明IL-17具有抗真菌感染、增强免疫的功能。该研究不仅探讨了卡氏肺孢子菌的检测方法和免疫应答反应,也为深入了解孢子虫感染的致病机制提供了有价值的信息。