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超低温条件下对精液进行冷冻保存,对保护动物种质资源有突出的应用优势。精液冷冻保存相关的技术方案,在人、牛身上已有所应用,同时得到了比较满意的冷冻效果。本文选取姜曲海猪精液作为实验样本,旨在构建与猪精液冷冻保存配套的技术方案,为猪人工授精奠定可靠的技术支撑。本试验主要结果如下:(1)猪精液品质的评价方法及相关性研究以“手握法”获取已成年、体质健康的姜曲海公猪精液,依次使用磷酸盐缓冲液、保存液以及冷冻基础液等进行稀释,于4℃条件下存储,统计精子活率、线粒体活性以及顶体完整率等多项指标。同时采集卵母细胞进行体外授精及胚胎培养。结果表明,体外授精率与精子形态呈显著正相关。精子活率上升后,卵裂率相对也会提升;卵子受精率和精子顶体完整率之间呈显著正相关;顶体完整率越高,卵子越容易受精;并且卵子受精率也和线粒体活性呈显著正相关。(2)猪精液超低温冷冻保存技术的研究本试验以成年、健康的姜曲海公猪精液作为样本,分析冷冻保护剂、液氮熏蒸高度两项指标对精液品质的影响。结果表明,将乙二醇作为冷冻保护剂,精液解冻后可以达到最理想的效果,在运动度、质膜破损率、顶体完整率和线粒体活性等指标上与二甲基亚砜(Dimethyl sulphoxide,DMSO)、丙二醇(Propylene glycol)组有显著差异(P<0.05),而与甘油组无显著差异(P>0.05)。距离液氮面相隔不同高度进行熏蒸冷冻,距离液氮面9 cm高度的熏蒸效果相对来说最差,与2 cm和5 cm高度熏蒸各试验指标相比均存在显著差异(P<0.05)。距离液氮面2 cm和5 cm高度熏蒸效果相比,除5 cm高度熏蒸组顶体完整率显著高于(P<0.05)2 cm高度熏蒸组外,二者运动度、质膜破损率和线粒体活性间均无显著差异(P>0.05)。冷冻液中添加十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfonate,SDS)以及维生素C(Vitamin C,Vc),均可以对精液冷冻效果优化。SDS和Vc同时添加的效果最为理想。而除Vc组运动度相较于其他组更低外(P<0.05),其余指标无显著差异(P>0.05);冷冻液中添加谷胱甘肽(Glutataione,GSH)以及透明质酸(Hyaluronic acid,HA),体外受精卵裂率无显著变化(P>0.05),活力、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)活性以及顶体完整率则显著提高(P<0.05);同时添加GSH+HA(5mmol.GSH-1、900 μg·mL-1)可以达到最理想的效果,在增强猪精子活力、保持SOD活性的同时,还可以大幅地提升体外受精卵裂率。猪精液冷冻液中添加不同浓度的菟丝子提取物(分为低剂量组、中剂量组和高剂量组),检测精子形态正常率以及SOD活性等。结果表明,经过冷冻-解冻,猪精子形态正常率和质膜完整率均大幅度下降(P<0.05)。加入菟丝子的精子SOD活性在一定程度上高于冷冻组,其中低剂量组达到显著水平(P<0.05)。菟丝子中剂量组精子MDA含量低于其他冷冻组,与菟丝子低剂量组和Vc组存在显著差异(P<0.05)。可见剂量适中的菟丝子提取物可以抑制冷冻诱发的膜损伤,增强精子自身的SOD活性,减小MDA含量。