研究背景:慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)是一种严重威胁人类健康的全球性疾病,且近年来发病率有逐年增高的趋势。据统计,在我国终末期肾病(end stage renal diseases,ESRD)的患者约有十余万人之多,已经成为一个严重的社会问题。成人肾脏具有一定数量的肾单位,一旦受损很难再生。然而目前对于终末期肾病并没有理想有效的治疗方式,现今的治疗主要有两种:透析和肾脏移植。透析治疗严重影响着患者的生活质量,并且使患者家庭承担了巨大的经济负担。且长时间的透析会产生心血管疾病、骨病等多种并发症。肾脏移植是当前治疗ESRD最有效的治疗方法,但是供体短缺及严重的免疫排斥反应很大程度上限制了其广泛应用。因此,对于临床医生来说迫切地需要寻找一种新的治疗ESRD措施。肾脏再生的目的在于在建立一个具备完整肾脏结构和功能的人工肾脏,目前肾脏再生的策略主要有六种:囊胚互补,体外诱导肾脏类器官,后肾移植,成体肾脏干细胞,生物人工肾(bioartificial kidney,BAK)和脱细胞肾支架(decellularized kidney scaffold,DKS)。囊胚互补是指在sall1基因缺失的小鼠囊胚内通过显微注射外源性干细胞,使干细胞与囊胚共同发育并形成嵌合体,进而获得外源性干细胞来源的肾脏,该方法的优点在于细胞来源可自主选择并且可获得完整肾脏,但是由于外源干细胞和囊胚所产生的嵌合体存在严重的伦理问题,因此并不能成为理想的肾脏再生方法。肾脏类器官研究,干细胞是一种能够向各种细胞类型分化的细胞类型,通过向培养基中添加生长因子可以体外诱导多能干细胞向肾系分化,而后通过3D培养可以获得具有立体结构的肾脏类器官,期望通过细胞的自我组装成为组织器官。其缺点是缺乏血管供应,且分化效率较低。后肾移植是通过解剖获取胚胎期的后肾组织移植到肾衰动物体内,可以一定程度上缓解肾衰程度,后肾细胞处于肾脏前体细胞或肾脏祖细胞发育阶段,因此具有较高的多能性,并且免疫原性较低,但是因为需要使用胚胎肾脏进行移植,同样存在伦理问题,限制了临床应用。肾脏干细胞是成体干细胞中研究最晚的一类干细胞,理论上肾乳头为肾脏干细胞的壁龛,通过分离肾脏干细胞并在体外培养,可在培养分化出肾脏细胞,用于肾脏再生研究。但是目前对于肾脏干细胞的研究主要集中在发育中的胚胎肾。研究表明,肾脏干细胞来源于输尿管芽诱导的后肾间质,但当前对肾脏成体干细胞的分离技术尚不成熟,还有待深入研究。生物人工肾是将工程科学技术与再生医学相结合的装置,用以起到替代肾脏功能的作用,该技术能够一定程度上维持尿毒症患者在肾功能衰竭状态下的生存。干细胞结合肾脏脱细胞支架构建组织工程肾脏是一种实现肾脏再生的新方法,有望能够起到肾脏替代治疗的作用,因此成为近年来再生医学研究的热点课题之一。肾脏脱细胞支架技术是指将动物成体的肾脏组织经化学和物理方法去除原本肾脏中的自体细胞,剩余无免疫原性或低免疫源性的细胞外基质,将其作为生物材料用于构建组织工程支架,而后使用成体细胞或者干细胞灌注脱细胞支架使之再细胞化,经过一段时间的共培养获得具有一定功能的组织工程肾脏。脱细胞支架由于原本的供体细胞被洗脱因而免疫源性大大降低,并且保留了正常肾脏的结构和细胞外因子,有利于种子细胞在支架内的生长和分化。对于种子细胞的选择,正常肾脏中细胞种类较为复杂,难以选择一种或者几种成体细胞进行肾脏再生。近年来对干细胞的研究日益深入,干细胞具有多向分化且无限增殖的特性,能够在不同的环境条件下向不同的细胞类型分化,因此是一类比较理想的种子细胞类型。先前的研究中曾利用胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESCs)、脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)、大鼠后肾间质细胞等结合脱细胞支架进行肾脏再生研究,但是上述细胞均存在伦理问题而不能进一步应用于临床。脂肪干细胞(Adipose tissue-derived stem cells,ADSCs)是一种易于获取、容易培养并且具有多项分化潜能的干细胞类型。脂肪干细胞来源于中胚层,在特异性生长因子和环境的影响下可以跨越胚层分化。间介中胚层(Intermediate mesoderm,IM)是中胚层阶段的一部分,其主要的分化方向为肾脏和性腺,是肾实质结构的来源。研究目的:本实验拟采用脂肪干细胞在体外环境下通过添加诱导因子诱导其分化为间介中胚层细胞,之后用于对肾脏脱细胞支架的再细胞化,从而构建有肾脏结构和部分功能的组织工程肾脏。研究方法:1.分离、培养原代ADSCs:取大鼠腹股沟脂肪垫脂肪,经过消化离心等步骤获取原代脂肪干细胞,传至第四代用于后续实验,通过光镜观察细胞形态,诱导成脂分化,14天后进行油红O染色,成骨分化21天后进行茜素红染色,成软骨分化21天后进行阿利新蓝染色,鉴定其成脂、成骨、成软骨特性。利用流式细胞仪检测CD29,CD34,CD45,CD90,CD105的表达情况。2.诱导ADSCs向间介中胚层细胞分化:在不同时间节点依次向ADSCs培养基中加入CHIR99021和FGF9因子,诱导作用7天后获得间介中胚层细胞。通过光学显微镜对比诱导前后细胞形态变化,利用免疫荧光鉴定间介中胚层特异性标志物OSR1,PAX2的表达情况。Western blot重复验证OSR1,PAX2的表达,同时以小鼠9.5天胚胎体节后部组织作为阳性对照。3.脱细胞支架的制备:选取体重约250g的wistar大鼠,使用10%水合氯醛麻醉。之后做腹部正中切口并暴露腹主动脉,通过24G套管针灌注无菌PBS水冲出肾脏内血液,摘除肾脏后分别通过肾动脉和输尿管留置24G和26G套管针。应用0.5%十二烷基硫磺酸钠(Sodium-dodecyl sulphate,SDS)持续灌注肾脏,洗脱肾脏细胞6小时,再使用无菌PBS冲洗残留SDS后获得可用于后续实验的脱细胞支架。4.对比脱细胞前后的变化:通过HE染色对比正常肾脏和脱细胞支架的形态结构,masson染色观察正常肾脏和脱细胞支架中胶原的表达情况,通过电镜对比肾脏组织和支架的亚显微结构的差异。5.对肾脏组织和脱细胞支架中DNA含量,胶原含量和细胞因子的测定:应用DNA和胶原测定试剂盒检测肾脏组织和脱细胞支架中的DNA和胶原的含量,通过ELISA检测对比肾组织和支架中HGF,VEGF,TGF-β的含量差异,并进行统计学分析。6.脱细胞支架再细胞化:将诱导后获取的IM细胞由肾动脉和输尿管端注入,灌注培养基,持续供氧,共培养10天后收获再细胞化的肾脏,通过HE染色观察支架内细胞贴附情况,利用免疫荧光鉴定肾小管标志物E-CAD,GATA3,足细胞标志物WT1的表达情况。同时将ADSCs灌注支架,单纯体外培养的ADSCs和IM细胞作为对照进行荧光染色。研究结果:1.光学显微镜下观察ADSCs的形态为长梭形,成脂分化14天进行后油红O染色,可见红色脂滴的产生;成骨分化21天后进行茜素红染色,可见骨化结节着色;成软骨分化21天后进行阿利新蓝染色,观察到软骨球被染成蓝色。进行流式细胞鉴定CD29,CD34,CD45,CD90,CD105的表达情况,阳性率分别为99.9%,1.1%,2.4%,100%和97.2%,符合ADSCs的表型。2.经过7天的间介中胚层诱导分化,可以观察到细胞产生形态变化。免疫荧光观察OSR1和PAX2的表达在IM细胞中明显高于ADSCs。Western blot可见OSR1和PAX的阳性表达。3.经过6小时的0.5%SDS脱细胞处理,通过肉眼观察肾脏逐渐变为透明样,表明支架内细胞被从原先肾脏结构上洗脱完全。4.通过HE染色对比脱细胞支架和正常肾脏组织可以发现,脱细胞支架内没有细胞存留,表明脱细胞完全。masson染色观察发现脱细胞过程胶原被完整的保留。扫描电镜观察脱细胞支架微结构与正常肾脏组织相比没有明显破坏。5.DNA测定脱细胞支架中DNA低于正常含量的5%以下;胶原含量与正常组没有明显差异;HGF,VEGF,TGF-β与正常组相比亦无明显改变。6.HE染色观察ADSCs通过动脉、输尿管结合脱细胞支架可以观察到细胞分布于血管、肾小球、肾小管等部位;IM结合脱细胞支架观察到同样的结果。免疫荧光鉴定细胞的分化情况观察E-CAD,GATA3,WT1的表达,可以发现IM在支架中上述标志物的阳性率较ADSCs结合支架组高,且单纯体外培养ADSCs和IM没有观察到上述标志物的表达。研究结论:间介中胚层细胞结合肾脏脱细胞支架后较未经诱导的干细胞结合支架有更高的分化效率。间介中胚层细胞在支架内可以观察到足细胞样和肾小管样细胞的表达。由此说明体外诱导干细胞产生进一步分化后再结合肾脏脱细胞支架是一种可行的肾脏再生策略。同时,肾脏脱细胞支架可以作为一种良好的生物材料用于肾脏再生研究。