背景：肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌总数约80%,尽管人们根据不同的肺癌分期采用了包括手术切除、化疗、放疗及靶向药物治疗在内的综合治疗方案,但从1975年到2011年NSCLC的总体五年生存率改善并不明显,只是从13%增加到16%,早期可切除NSCLC的5年生存率也只有60%～70%,最终1/4～1/3的患者仍死于转移和复发。为进一步改善NSCLC患者的治疗效果和预后,迫切需要研究与NSCLC转移和复发密切相关的肿瘤侵袭和转移的分子机制,并根据其信号通路和关键调控因子设计和寻找抗侵袭和转移的新途径。大量研究已经证实缺氧可以促进肿瘤的发生和发展,在这个过程中,缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor, HIF)家族起着非常重要的作用。HIF-1和HIF-2是缺氧诱导因子家族中最重要的两种参与组织乏氧调控的因子,尽管在基因序列上HIF-1α和HIF-2α之间具有明显的同源性,但他们在肿瘤的进展中发挥重要的但不重叠的作用。近年来在乳腺癌、肾透明细胞癌、肺癌、神经母细胞瘤的一些研究发现HIF-2α而不是HIF-1α为促进肿瘤进展的主要调节因子,HIF-2α与恶性肿瘤转移以及预后关系密切,HIF-2α可能是NSCLC患者评估肿瘤恶性风险一个有用的指标和潜在的一个肿瘤防治目标。然而,HIF-2α是通过哪些途径促进NSCLC侵袭和转移以及相关的分子机制仍然不清楚。肿瘤血管生成和淋巴管生成对实体瘤经血管、淋巴管播散具有重要的作用,是发生转移的主要途径,其中VEGF-A、VEGF-C分别是调控血管生成和淋巴管生成的主要因子。上皮-间质转变(epithelial-mesenchvmal transition, EMT)是近年来包括肺癌在内的恶性肿瘤基础研究的热点,大量研究表明肿瘤细胞发生EMT后侵袭性明显增强,更容易发生转移。NSCLC肿瘤组织中HIF-2α是否通过影响肿瘤血管生成和淋巴管生成以及EMT促进肿瘤侵袭和转移至今仍不明确。目的：探讨HIF-2α在非小细胞肺癌进展过程中的作用及其与肿瘤血管生成和淋巴管生成和EMT的关系。方法：1.采用免疫组织化学染色法观察52例手术切除的非小细胞肺癌组织中HIF-2α、HIF-1α蛋白的表达情况,分析HIF-2α、HIF-1α蛋白与肺癌临床病理因素的关系。2.采用CD31和D2-40分别标记肿瘤微血管和微淋巴管,免疫组织化学染色染色法观察肿瘤微血管密度和微淋巴管密度以及VEGF-A、VEGF-C蛋白的表达情况,分析HIF-2α、HIF-1α蛋白与肿瘤血管生成和淋巴管生成的关系。3.采用免疫组织化学染色法观察EMT相关蛋白的表达情况,分析HIF-2α、HIF-1α蛋白表达与EMT相关蛋白表达的关系。4.构建特异性HIF-2α siRNA表达载体,并借助脂质体将其转入人肺癌A549细胞,实验分为空白对照组(未转染的A549细胞)、阴性对照组(阴性质粒转染的A549细胞)和HIF-2α siRNA组(HIF-2α siRNA质粒转染的A549细胞)。采用光镜动态观察、Real time PCR以及Western Blotting、细胞免疫荧光染色等方法在细胞形态、mRNA、蛋白水平检测细胞相关因子的表达变化,分析HIF-2α对人肺癌A549细胞EMT和VEGF-AVEGF-C表达的调节作用。结果：1.本组52例非小细胞肺癌组织中HEF-2α蛋白表达和HIF-1α蛋白表达不相关(P>0.05)；HIF-2α蛋白表达与肿瘤血管侵犯、淋巴管侵犯、淋巴结转移密切相关(均P<0.01),HIF-1α蛋白表达与各临床病理因素均不相关(均P>0.05)；单因素生存分析显示HIF-2α蛋白阳性表达组生存率明显低于阴性表达组(P=0.012),HIF-1α蛋白阳性表达组与阴性表达组生存率差别无统计学意义(P>0.05)；COX多因素生存分析表明HIF-2α而不是HIF-1α蛋白表达是NSCLC患者术后的一个独立预后因素。2.本组52例非小细胞肺癌组织HIF-2α蛋白表达阳性组的未形成完整管腔的MVD值及LMVD值均大于HIF-2α阴性组(P=0.000,0.031), HIF-1α表达阳性组与HIF-1α表达阴性组中MVD、未形成完整管腔的MVD、LMVD相比,差异均不具有统计学意义(均P>0.05),HIF-2α表达与VEGF-A、VEGF-C表达均呈正相关(r=0.428,0.316,P=0.002,0.022)。3.本组52例非小细胞肺癌组织HIF-2a蛋白表达与E-cadherin蛋白表达呈负相关(r=-0.451, P=0.001), HIF-2α蛋白表达与Vimentin蛋白表达呈正相关(r=0.321,P=0.020)。4.乏氧的肺癌A549细胞的HIF-2a蛋白表达明显增高,而E-cadherin蛋白表达明显降低,同时Vimentin、Twist、VEGF-A和VEGF-C蛋白表达均增高,细胞由上皮型生长模式向间质型生长转变。5.成功构建了HIF-2a siRNA表达载体并且能高效转入A549细胞内。与阴性对照组比较,三对siRNA-HIF-2a中以HIF-2a-siRNA-1331对HIF-2a蛋白沉默效果最为显著(P均<0.05),转染HIF-2a-siRNA-1331组中HIF-2a mRNA沉默效率达到了70.27%。HIF-2α-siRNA转染乏氧培养的A549细胞后,与阴性对照组和空白对照组相比,Real time PCR实验结果显示E-cadherin mRNA相对表达量明显增高(均P<0.01),Twist和VEGF-AmRNA相对表达量均降低(均P<0.05); Western blotting实验结果显示E-cadherin蛋白表达明显增高(P<0.01), Vimentin、Twist、VEGF-A和VEGF-C蛋白表达均明显降低(均P<0.01)。结论：1.非小细胞肺癌组织中HIF-2α蛋白阳性表达不仅与非小细胞肺癌的侵袭和转移密切相关,也可作为判断非小细胞肺癌患者预后的指标之一。2. HIF-2α对非小细胞肺癌血管生成和淋巴管生成起正调控作用,LMVD和未形成完整管腔的MVD增多,可能为癌细胞淋巴道转移和血行转移提供更多的途径,从而具有更高的发生转移的风险。3. HIF-2α可通过上调VEGF-A、VEGF-C的表达分别促进非小细胞肺癌血管生成和淋巴管生成。4. HIF-2α参与了非小细胞肺癌的上皮-间质转变过程,促进肿瘤的浸润及转移。5. HIF-2α siRNA表达载体能有效抑制乏氧的肺癌A549细胞HIF-2α mRNA及蛋白的表达；沉默HIF-2α在肺癌A549细胞中的表达可抑制A549细胞上皮-间质转变和VEGF-A、VEGF-C的表达。