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目的： 研究miR-424在结核分枝杆菌感染单核/巨噬细胞免疫应答中的调控作用，并进一步探讨其发挥作用的机制。 方法： 1、miR-424与结核分枝杆菌感染相关性研究： (1)分别分离健康人及活动性结核病人的外周血单个核细胞，免疫磁珠分选CD14+单核细胞，提取细胞总RNA，检测两组单核细胞中miR-424表达水平是否存在差异。 (2)减毒牛结核分枝杆菌BCG感染人单核/巨噬细胞株THP1细胞，提取细胞总RNA，检测不同时间点及不同菌感染浓度下miR-424表达水平。 (3)减毒牛结核分枝杆菌BCG感染健康人原代外周血单核细胞，提取细胞总RNA，检测不同时间点miR-424表达水平。 (4)1μg/ml的PPD刺激THP1细胞，提取细胞总RNA，检测不同时间点miR-424表达水平。 (5)200μg/ml的CFP10-ESAT6融合蛋白刺激THP1细胞，提取细胞总RNA，检测不同时间点miR-424表达水平。 2、miR-424促进细胞凋亡的功能及机制研究： (1)在THP1细胞中瞬时转染miR-424 mimic或者control mimic，采用MTT的方法检测miR-424不同转染浓度及不同转染时间对细胞生存率的影响。流式检测miR-424是否影响THP1细胞凋亡。采用WB检测Caspase-3的剪切，研究miR-424促进细胞凋亡是否依赖Caspase的激活。 (2)应用Targetscan在线软件预测，BCL-2可能是miR-424的靶基因。首先在THP1细胞中瞬时转染miR-424 mimic或者control mimic，qRT-PCR检测过表达效果，然后检测miR-424高表达时，Bcl-2在mRNA及蛋白水平变化。 (3)构建pSG5-FLAG-Bcl-2真核过表达质粒，验证其过表达效果。在THP1中瞬时过表达Bcl-2，同时转染miR-424 mimic，通过WB检测Caspase-3和PARP的剪切，观察miR-424促进细胞凋亡的功能是否被消除。 3、miR-424影响巨噬细胞中减毒牛结核分枝杆菌BCG吞噬和清除的研究： (1)THP1诱导的巨噬细胞中瞬时转染miR-424 mimic或者control mimic，用Texas-red标记的BCG感染不同时间后洗去胞外菌，流式检测miR-424是否影响巨噬细胞的吞噬功能。 (2)THP1诱导的或人原代单核细胞诱导的巨噬细胞中瞬时转染miR-424mimic或者control mimic，MOI.5的牛结核分枝杆菌BCG感染1h后，洗去胞外菌，收集不同时间点的细胞，将细胞裂解液按照不同稀释浓度涂布在Middle brook7H10平板上，培养3周后，计数菌落数。研究miR-424是否影响巨噬细胞对BCG的清除功能。 结果： 1、miR-424与结核分枝杆菌感染相关性研究: 活动性结核病人组外周血单核细胞中miR-424水平约是健康人组的2倍。牛结核分枝杆菌BCG体外感染THP1细胞后，miR-424的水平随着BCG的感染时间及感染量的增加而增加。其中，BCG感染MOI为5时，感染后60 h，miR-424的水平最高。而人原代单核细胞中，BCG感染后miR-424表达量变化没有THP1中的变化明显，但是感染24 h是未感染的4倍，仍然具有显著性差异(P＜0.5)。因此我们猜测:miR-424的差异表达可能与结核分枝杆菌感染引起的单核细胞免疫反应相关。而PPD刺激THP1细胞后，miR-424表达水平没有明显变化，CFP10-ESAT6融合蛋白刺激THP1细胞后，miR-424表达水平有下降的趋势，但没有统计学意义。这些实验结果表明:miR-424在活动性结核病人外周血单核细胞中表达水平的升高，主要是由BCG和致病性结核分枝杆菌共有的成分引起的。 2、miR-424促进细胞凋亡的功能及机制研究: MTT实验结果证明:THP1高表达miR-424时，活细胞数明显少于对照组，并且与miR-424 mimic转染浓度及转染时间呈负相关。该结果表明，高水平的miR-424不利于细胞的生存。AnnexinⅤ/PI双染流式检测细胞凋亡结果证明，THP1高表达miR-424组，凋亡细胞比例为15.8％，而THP1低表达miR-424组，凋亡细胞的比例只有2.95％。WB的结果中，无论是否有BCG感染，miR-424高表达组中Caspase-3的剪切都明显多于对照组。综上所述，miR-424促进THP1细胞凋亡，并且依赖Caspase-3的激活。 Targetscan在线软件预测到miR-424有成百个可能的靶基因，其中Bcl-2的3，UTR上含有与miR-424种子序列相匹配的碱基。然而miR-424与Bcl-2的3，UTR端为不完美配对，理论上会抑制Bcl-2 mRNA的翻译，而不一定会引起剪切。qRT-PCR及WB的结果与上述推论相符，无论是否有BCG感染，高水平的miR-424降低Bcl-2的蛋白水平，而并不影响Bcl-2的mRNA水平。 构建的pSG5-FLAG-Bcl-2真核过表达质粒，由于该外源性Bcl-2 mRNA没有3 UTR端，因此不会受到miR-424的调控。当在THP1中同时过表达Bcl-2和miR-424时，与对照组相比，都没有Caspase-3和PARP的剪切。综上所述:miR-424促进THP1细胞凋亡是通过靶向调控Bcl-2的翻译实现的。 3、miR-424影响巨噬细胞中牛结核分枝杆菌BCG吞噬和清除的研究: 在感染后1h、6h和24 h，过表达miR-424的巨噬细胞中胞内BCG的存活量明显减小。但是过表达miR-424并不影响巨噬细胞对BCG的吞噬功能。 结论： 1、结核分枝杆菌感染促进单核细胞中miR-424表达; 2、miR-424通过靶向调控Bcl-2的翻译，促进THP1细胞凋亡; 3、miR-424促进巨噬细胞吞噬的牛结核分枝杆菌BCG的清除。