猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus type 2,PCV2）是导致猪圆环病毒相关疾病和猪断奶后多系统衰竭综合征的主要病原体,该病毒广泛存在于家猪和野猪群体中,是全世界养猪业面临的难题。衣壳蛋白（Capsid protein,Cap）是PCV2的主要免疫原性蛋白和唯一结构蛋白,因此该蛋白是药物、疫苗和试剂盒研发的关键靶点。抗独特型抗体（Anti-idiotypic antibody,AId or Ab2）是以抗体分子可变区的独特型作为抗原表位诱导产生的特异性抗体,根据其识别抗体分子（Ab1）上位点的不同可以分为4种类型:α-AId、β-AId、γ-AId和δ-AId。其中的β-AId能识别抗体分子（Ab1）上与抗原结合的独特位,能够模拟初始抗原上与抗体结合的决定簇,又称为抗原分子的“内影像（Internal image）”,因此β-AId可以作为抗原替代物开发新型抗独特型抗体疫苗,尤其是在肿瘤免疫治疗方面已经取得进展。骆驼科动物血清中含有传统抗体和重链抗体（Heavy chain-only Antibodies,Hc Abs）,Hc Ab只有一种重链可变区（VHH）,因此免疫骆驼后通过噬菌体展示技术可以筛选到与免疫原特异性结合的VHH,由于其分子量仅15 k Da左右,单独的VHH区域又被称为纳米抗体（Nanobody,Nb）。与传统抗体相比,纳米抗体具有体积更小、特异性更高、亲和力以及结合抗原的能力更强、成本低廉和易于大量生产的优点,目前已被广泛应用于多种疾病的检测诊断与治疗、新型疫苗的研发等领域。基于上述背景,本研究成功获得了能够模拟PCV2 Cap蛋白关键抗原表位的β型抗独特型纳米抗体,取得的主要研究结果如下:1.抗PCV2 Cap蛋白单克隆抗体1E7的纯化与鉴定。使用Protein G纯化含有抗PCV2 Cap蛋白单克隆抗体1E7的BALB/c小鼠腹水,产量约1.6 mg/m L。在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达重组p ET 28a-PCV2 Cap（Gen Bank ID:FJ644919）可溶性蛋白,并使用镍离子亲和层析柱对其进行纯化,产量约为20 mg/L。通过IFA、间接ELISA和Western Blot鉴定纯化后的单抗1E7特异性结合PCV2 Cap蛋白。2.双峰驼免疫与抗独特型纳米抗体的筛选。将纯化后的单抗1E7免疫双峰驼6次,每次免疫2 mg。第5次免疫两周后检测双峰驼血清中特异性针对单抗1E7的抗体效价达到1:10~6,于第6次免疫的一周后采集双峰驼外周血液并分离淋巴细胞,提取淋巴细胞RNA后反转录,巢式PCR技术扩增VHH基因,构建库容量为7×10~9噬菌体重组抗体文库。采用噬菌体展示技术,以单抗1E7为靶分子,经历3轮淘选,从重组抗体文库筛选到12株纳米抗体粗提物能够特异性结合单抗1E7重链可变区。3.毕赤酵母系统表达抗独特型纳米抗体与纯化鉴定。构建12株纳米抗体毕赤酵母重组表达载体VHH-p PICZαA,电转化至X-33毕赤酵母感受态细胞,挑选阳性单克隆后甲醇诱导表达并鉴定,纯化后产量约为70～80 mg/L。间接ELISA验证纳米抗体与单抗1E7特异性结合效价。阻断ELISA验证十株纳米抗体能够有效阻断PCV2Cap蛋白与单抗1E7的结合,阻断率达96%。4.抗独特型纳米抗体模拟PCV2 Cap蛋白抗原表位的鉴定。对比十株纳米抗体CDR3区域与PCV2 Cap蛋白氨基酸序列,确定了目标抗独特型纳米抗体Nb39和Nb61（二者只存在3个氨基酸差异）。合成PCV2 Cap蛋白和Nb61相关短肽,通过Pep Scan技术确定了单抗1E7识别PCV2 Cap蛋白的抗原表位位置aa 75-80(75NINDFL80)和识别Nb61的抗原表位位置aa 101-106(CDR3区域:101NYNDFL106)。对比发现,二者的抗原表位都包括6个关键氨基酸,且Nb61的CDR3区域抗原表位与之所模拟的PCV2 Cap蛋白抗原表位的6个关键氨基酸存在5个氨基酸的一致。使用Nb39和Nb61免疫BALB/c小鼠,检测小鼠血清中有特异性结合初始抗原PCV2 Cap蛋白的抗体Ab3产生。综上所述,本研究首次通过噬菌体展示技术筛选到PCV2 Cap蛋白抗独特型纳米抗体,使用毕赤酵母表达系统成功对其进行上清表达和纯化。通过阻断ELISA成功验证了该抗独特型纳米抗体为β-AId。PCV2 Cap蛋白抗独特型纳米抗体的制备,可以为之后PCV2易感细胞表面受体的寻找、PCV2诊断和治疗试剂的开发及新型抗独特型抗体疫苗的研发提供物质基础。