特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种病因不明，致死率很高的肺间质性疾病。目前临床上没有有效的药物进行治疗，确诊后的患者中位生存期不到3年。研究表明肺间质干细胞在IPF的发生发展中起着重要的作用。肺间质干细胞在所处微环境的影响下可以向成纤维细胞分化，进而分泌胶原、纤维蛋白等大量细胞外基质，成为导致IPF发生的重要因素。有文献表明miRNA在干细胞的分化过程中起着非常重要的作用，并且在IPF病人的肺组织中miRNA的表达谱出现异常，提示miRNA在肺纤维化的发生发展中起着重要的作用。因此本课题将从miRNA的角度探讨肺纤维化发生发展的分子机制，并尝试以关键miRNA为靶点来干预IPF的发生。此外，实验室前期研究证实Wnt信号通路影响了肺间质干细胞的分化方向，所以在本研究中，我们还将在IPF动物模型中探究调控Wnt信号通路对IPF的干预作用。　　全文分为四部分:　　第一部分 小鼠特发性肺纤维化模型的建立　　目的:　　建立特发性肺纤维化小鼠模型，通过检测肺功能、肺组织结构及肺内成纤维相关蛋白表达情况，确认模型的成功建立。　　方法:　　C57BL/6小鼠腹腔麻醉后，通过气管内雾化给予博来霉素的方法建立IPF动物模型。　　结果：　　博来霉素均匀的分布在小鼠肺组织中，小鼠苏醒后生存状态良好。　　结论：　　经气道雾化给予小鼠博来霉素建立的特发性肺纤维化模型，肺泡结构紊乱，胶原在肺间质中堆积，动脉血中氧分压下降，肺组织中上皮标记减少，成纤维标记增加，以上变化与人类特发性肺纤维化的进程相似。并且经气道雾化给药方式与常规的气道滴入方式相比，具有病灶均一，建模成功率高等优点，更适合于特发性肺纤维化的基础研究。　　第二部分 microRNA在特发性肺纤维化发生发展中的作用机制探讨　　(Ⅰ)肺间质干细胞向成纤维细胞分化过程中miRNA表达谱变化的研究　　目的：　　确认肺间质干细胞可以向成纤维细胞分化，并探究在这一分化过程中miRNA表达谱的变化，筛选与纤维化发生相关的miRNA。　　方法：　　1.采用磁珠分选的方法分离提取小鼠肺间质干细胞并通过流式细胞术进行鉴定。　　2.经TGF-β诱导肺间质干细胞向成纤维细胞分化，并通过western blotting和免疫荧光进行确认。　　结果：　　1.在光镜观察下，肺间质干细胞呈现出长梭形、纺锤体的形态并呈旋涡状排布。经流式细胞术鉴定，细胞表达SCA-1和CD29，不表达CD31，CD34和CD45。　　2.经过TGF-β连续诱导7天后，通过western blotting和免疫荧光检测发现肺间质干细胞中成纤维细胞的标记α-SMA，CollagenⅠ和fibronectin的表达量明显增加。　　结论：　　1.成功分离培养了原代肺间质干细胞，并通过TGF-β促使其向成纤维细胞分化。　　2.在肺间质干细胞向成纤维细胞分化过程中有299种miRNA的表达发生改变，其中252种miRNA显著上调，47种miRNA显著下调。数据库预测发现表达升高最显著的miR-877-3p靶基因为Smad7，可能与肺纤维化的发生密切相关。　　(Ⅱ)miR-877-3p在肺间质干细胞向成纤维细胞分化过程中的作用机制研究　　目的：　　探讨miR-877-3p在肺间质干细胞向成纤维细胞分化过程中的作用机制。　　方法：　　1.构建含Smad7与miR-877-3p互补配对碱基序列的荧光素酶报告基因重组质粒，采用脂质体转染外源性miR-877-3p或miRNA negative control和重组质粒或空载质粒进入293T细胞，验证miR-877-3p与Smad7之间的作用关系。　　2.构建含miR-877-3p或其反义序列的慢病毒(LV-miR-877-3p，LV-miR-877-3pinhibitor)，采用常规慢病毒转染方法将其分别转入肺间质干细胞中。采用Q-PCR的方法检测在肺间质干细胞中miR-877-3p的表达水平;采用westernblotting实验技术检测Smad7蛋白表达水平，验证miR-877-3p与Smad7之间的调控作用关系。　　结果：　　1.与转染阴性对照质粒组相比，转染了miR-877-3p质粒后能显著降低装载野生型Smad7序列的萤光素酶活性，而对阴性对照萤光素酶质粒和装载突变型Smad7序列的萤光素酶活性没有影响。　　2.通过Q-PCR检测发现转染LV-miR-877-3p后能显著升高miR-877-3p的表达量，转染miR-877-3p inhibitor后能明显降低miR-877-3p的表达量。通过western blotting检测发现过表达miR-877-3p能够显著抑制Smad7的表达，而下调miR-877-3p的表达能够使Smad7的表达升高。　　结论：　　1.Smad7为miR-877-3p的靶基因，并且过表达miR-877-3p能够抑制Smad7的表达。　　2.miR-877-3p并没有在转录水平对Smad7产生影响，而是在翻译水平抑制了 Smad7的表达，符合miRNA的作用机制。　　3.miR-877-3p能抑制靶基因Smad7的表达，从而导致下游Smad2和Smad3蛋白磷酸化水平升高，促进了肺间质干细胞向成纤维细胞分化，是肺纤维化发生发展的重要机制。　　第三部分 调控miR-877-3p对IPF小鼠肺纤维化发生发展的干预研究　　目的：　　探究调控miR-877-3p对IPF小鼠肺纤维化发生发展的影响，为临床治疗IPF提供新思路和理论依据。　　方法：　　1.给予小鼠慢病毒后通过荧光显微镜观察了慢病毒GFP蛋白的表达情况。　　2.实验小鼠共分为三组:阴性对照慢病毒对照组(LV-NC)，阴性慢病毒+博来霉素组(LV-NC+BLM)，miR-877-3p inhibitor慢病毒+博来霉素组（LV-miR-877-3p inhibitor+BLM）。通过Q-PCR检测了各组中miR-877-3p的表达量。　　结果：　　1.对照组基本没有绿色荧光，而转染慢病毒组的绿色荧光明亮，且均匀分布。　　2.与对照组相比，LV-NC+BLM组的miR-877-3p表达明显增多，而LV-miR-877-3p inhibitor+BLM组则没有发生明显变化。　　结论：　　下调miR-877-3p的表达能够抑制TGF-β/Smad信号通路，从而控制了肺纤维化的发生发展。　　第四部分 Wnt/β-catenin信号通路抑制剂NSC668036对IPF小鼠肺纤维化发生发展的干预研究　　目的：　　确认Wnt/β-catenin信号通路抑制剂NSC668036能够抑制IPF小鼠肺纤维化的发生发展，并能够抑制成纤维细胞的活化。　　方法：　　1.实验小鼠共分为三组:对照组，博来霉素组(BLM)，NSC668036+博来霉素组(NSC668036+BLM)。通过western blotting检测小鼠肺组织中Wnt信号通路相关蛋白的表达情况。　　2.采用HE染色检测评估抑制Wnt信号通路后对损伤肺组织结构的修复作用;采用马松染色及羟脯氨酸含量测定检测各组肺组织内胶原蛋白沉积的情况;采用western blotting和免疫荧光检测纤维化相关的蛋白(α-SMA，fibronectin)和Wnt/β-catenin信号通路重要蛋白β-catenin的表达水平改变的表达情况。　　3.配制含不同浓度的NSC668036的培养基体外培养NIH-3T3成纤维细胞。采用CCK-8检测细胞的增殖能力;通过划痕实验观察TGF-β，Wnt3α和NSC668036对NIH-3T3细胞迁移能力的影响;通过Q-PCR，western blotting和免疫荧光检测NIH-3T3细胞的活化水平。　　结果：　　1.与对照组相比，肺纤维化模型组中β-catenin和p-GSK-3β的表达水平升高。　　2.抑制Wnt信号通路后肺组织中纤维增生面积明显减少，肺泡结构趋于正常，胶原蛋白的沉积明显降低，肺组织中纤维化相关蛋白的表达被显著抑制。　　3.培养基中NSC668036的浓度在高于10μM时对NIH-3T3成纤维细胞的增殖能力具有明显的抑制作用。与对照组相比，TGF-β和Wnt3α都能显著促进细胞的迁移，NSC668036能够抑制细胞的迁移，并且能够明显逆转TGF-β引起的细胞迁移。Wnt信号通路相关蛋白S100A4，MMP-7，β-catenin以及肌成纤维细胞的标记蛋白α-SMA和CollagenⅠ的表达在TGF-β或Wnt3α的作用下都显著上调，而NSC668036能显著抑制这些蛋白的表达。　　结论：　　1.在IPF小鼠肺组织中Wnt信号通路处于激活状态。　　2.Wnt/β-catenin信号通路抑制剂NSC668036能有效地抑制肺纤维化的发生发展。　　3.Wnt/β-catenin信号通路抑制剂NSC668036能有效地抑制NIH-3T3成纤维细胞的增殖能力，迁移能力及活化水平。