研究背景急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是一组起源于造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病,是成人急性白血病最主要的类型。目前通过联合化疗50%至70%的患者可达到完全缓解,然而其中约76%的患者最终会转变成为复发或难治白血病。化疗耐药的产生是造成白血病患者复发、难治的主要原因。因此,探索AML耐药机制并寻找有效靶点对提高AML疗效、改善患者预后至关重要。目前大部分化疗药物通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥治疗作用。研究表明,肿瘤细胞能够过表达BCL-2、MCL-1等多种抗凋亡分子以增强化疗耐药性。传统抗凋亡分子BCL-2、MCL-1的抑制剂虽可增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,但针对上述抑制剂的耐药问题也随之产生,这可能是由于肿瘤细胞代偿性地高表达新的抗凋亡分子。因此,探索肿瘤新的抗凋亡机制、寻找新的凋亡调控靶点迫在眉睫。肿瘤坏死因子 α 诱导蛋白 8（Tumor necrosis factor α-induced protein 8,TNFAIP8）是近年来发现的一种新的抗凋亡分子。研究发现,TNFAIP8参与肿瘤发生、发展及侵袭过程,并具有重要的调控作用。TNFAIP8在胃癌、食管鳞癌、结肠癌、胰腺癌等多种肿瘤中过表达,其高表达的肿瘤具有低分化、高度恶性、易远处转移的特点,临床预后不佳。此外,TNFAIP8与肿瘤耐药的相关性亦有报道,然而系统研究相对缺乏。以上相关研究初步展示了 TNFAIP8在实体肿瘤中的表达情况,但针对其在AML中的研究报道较少。有研究显示,TNFAIP8在K562、MOLT4两种白血病细胞系中表达较高。然而,对于TNFAIP8在AML患者中的表达情况、作用及机制研究较少。此外,TNFIAP8异常表达的调控机制仍不完全明确。研究目的一、探究TNFAIP8在成人AML患者及细胞系中的表达,阐明TNFAIP8在AML中的表达调控机制,为AML的早期诊断、预后评估以及发病机制研究提供新思路和分子研究基础。二、探讨TNFAIP8对AML细胞生物学行为的影响,明确TNFAIP8在AML耐药中的作用,进一步阐明TNFAIP8参与AML多药耐药的机制,为逆转AML耐药提供新的靶点。研究方法第一部分1.骨髓标本的收集、处理与检测:收集60例AML患者及17例健康对照的骨髓5-10 mL,使用Ficoll淋巴细胞分离液进行密度梯度离心法,分离骨髓单个核细胞。Real-Time RT-PCR和Western Blot法检测AML患者及健康对照者骨髓单个核细胞中的TNFAIP8表达水平。2.细胞系培养及TNFAIP8表达水平检测:人白血病细胞系HL60由IMDM为基础的完全培养基培养,另加入10%FBS、1%青链霉素混合液;人白血病细胞系THP1、U937、K562及其耐药株K562/A02、K562/G01,以及HL60耐药细胞系HL60/ADR由RPMI 1640为基础的完全培养基培养,另加入10%FBS、1%青链霉素混合液;人胚肾细胞系293T使用DMEM为基础的完全培养基培养,另加入10%FBS、1%青链霉素混合液。收集THP1、U937、K562、K562/A02、K562/G01,HL60、HL60/ADR 细胞,Real-Time RT-PCR 和 Western Blot 法检测TNFAIP8表达水平。3.病毒感染:将 E74 样 ETS 转录因子 1（E74 like ETS transcription factor 1,ELF1）过表达慢病毒、ELF1干扰慢病毒分别感染AML敏感细胞系与AML耐药细胞系,96h后加入嘌呤霉素进行抗性筛选,扩大培养。Real-Time RT-PCR和Western Blot法检测AML细胞TNFAIP8和ELF1表达水平。4.双荧光素酶报告基因分析:构建ELF1过表达质粒及其空载体H352,TNFAIP8启动子区萤火虫荧光素酶报告基因质粒pTNFAIP8-Prom及其对照质粒pGL4.10。应用Lipofectamine 2000转染试剂,将ELF1过表达质粒或其空载体H352,分别与TNFAIP8启动子区萤火虫荧光素酶报告基因质粒pTNFAIP8-Prom或对照质粒pGL4.10共转染293T细胞,海肾荧光素酶质粒pRL-CMV作为内参共转染,24 h后通过双荧光素酶报告基因系统测量荧光素酶的活性。5.染色质免疫共沉淀:选择生长状态良好、处于生长对数期的K562、HL60、K562/A02、HL60/ADR细胞,通过胞核制备和染色质消化、染色质免疫沉淀法、离心柱纯化DNA、定量PCR等步骤验证ELF1结合位点。6.统计分析:利用SPSS 25.0软件统计分析数据。实验数据均以平均值±标准差表示。应用Unpaired Student’st检验分析两组间的差异。三组及以上组间差异通过方差分析或非参数检验分析。P<0.05认为差异有统计学意义。第二部分1.细胞培养:人白血病细胞系HL60由IMDM为基础的完全培养基培养,另加入10%FBS、1%青链霉素混合液;人白血病细胞系K562、K562/A02、HL60/ADR由RPMI 1640为基础的完全培养基培养,另加入10%FBS、1%青链霉素混合液。2.病毒感染及稳筛:将人TNFAIP8过表达慢病毒、人TNFAIP8干扰慢病毒分别感染AML敏感细胞系与AML耐药细胞系,96 h后加入嘌呤霉素进行抗性筛选,扩大培养。Real-Time RT-PCR 和 Western Blot 法检测 AML 细胞 TNFAIP8表达水平。3.细胞增殖、凋亡及药物敏感性检测:将感染病毒后的细胞种于细胞培养板中,CCK8法检测细胞增殖速度;分别加入阿霉素、阿糖胞苷、伊达比星三种化疗药物孵育48 h,CCK8法检测药物敏感性,流式细胞术检测细胞凋亡率变化。4.免疫共沉淀:构建TNFAIP8表达载体,在293T细胞、K562细胞和HL60细胞中表达携带Flag标签的TNFAIP8,利用Flag一抗进行免疫沉淀,SDS-PAGE凝胶电泳后检测免疫沉淀蛋白中是否存在Rac1。5.Rac1活化检测:收集TNFAIP8表达上调后的AML敏感细胞与TNFAIP8表达下调后的AML耐药细胞,利用Rac1活化检测试剂盒检测各组细胞Rac1的活化水平。6.转录组测序:将三组下调TNFAIP8表达后的K562/A02细胞及三组对照K562/A02细胞进行扩增,取生长状态良好、处于对数生长期的细胞各1×106个,PBS洗涤后获得细胞沉淀,加入Trizol提取总RNA,送至上海其明有限公司进行Illumina HiSeq系列转录组测序。7.动物实验:购买C57BL/6来源的AML细胞系C1498,用携带绿色荧光蛋白的小鼠TNFAIP8下调慢病毒或对照慢病毒感染C1498细胞,嘌呤霉素稳定筛选及流式细胞术鉴定,建立稳定下调TNFAIP8基因表达的小鼠AML细胞系C1498-shTNFAIP8及对照细胞系C1498-shNC,通过尾静脉注射接种至6-8周龄的C57BL/6小鼠,建立TNFAIP8基因表达稳定下调的AML小鼠模型及对照AML小鼠模型,定期监测小鼠发病情况。小鼠出现发病表现后,对一批小鼠实施安乐死,解剖动物并进行指标检测,另一批小鼠记录生存期并绘制生存曲线。8.统计分析:利用SPSS 25.0软件统计分析数据。实验数据均以平均值±标准差表示。采用Unpaired Student’s t检验分析两组间的差异。三组及以上组间差异通过方差分析或非参数检验分析。P<0.05认为差异有统计学意义。研究结果第一部分1.TNFAIP8基因在AML中的表达研究1.1与健康对照者相比较,TNFAIP8 mRNA在AML患者中表达水平明显增高;TNFAIP8 mRNA在AML初诊、复发/难治患者中表达水平明显高于完全缓解患者;AML复发/难治患者中TNFAIP8 mRNA表达水平明显高于初诊患者。1.2白血病细胞系中普遍高表达TNFAIP8,其中TNFAIP8在耐药细胞株HL60/ADR和K562/A02中表达水平明显高于相应敏感细胞株HL60和K562。2.TNFAIP8基因转录的调控机制研究2.1 ChIPBase数据库预测结果显示,转录因子ELF1在TNFAIP8转录起始位点附近区域的可能的结合位点数目最多,ELF1可能是调控TNFAIP8转录的潜在上游分子。2.2 AML细胞中过表达ELF1能增加TNFAIP8 mRNA的表达水平,AML细胞中下调ELF1表达能明显降低TNFAIP8 mRNA的表达水平,提示ELF1能够调控TNFAIP8的转录。2.3 Luciferase检测显示转染pTNFAIP8-prom质粒的细胞荧光素酶活性明显高于转染空载体组,证实克隆的TNFAIP8启动子序列含有功能性区域;与对照组相比较,ELF1过表达后pTNFAIP8-Prom的荧光素酶活性明显增强,表明ELF1能够通过作用于TNFAIP8基因启动子区调控TNFAIP8的转录。2.4 CHIP实验证实TNFAIP8基因启动子区域的ELF1结合位点位于-1154～-1142bp。3.TNFAIP8与ELF1在AML中的表达呈正相关3.1与健康对照者相比较,ELF1在AML患者中表达水平明显增高。3.2ELF1在耐药细胞株HL60/ADR和K562/A02中表达水平高于相应敏感细胞株HL60和K562。3.3 AML患者中TNFAIP8的表达水平与ELF1的表达水平具有正相关关系。第二部分1.TNFAIP8下调对AML细胞生物学行为的影响1.1利用携带人TNFAIP8 shRNA的干扰慢病毒或对照慢病毒,感染TNFAIP8高表达的AML耐药细胞株,Real-Time RTPCR和Western Blot验证TNFAIP8表达水平下调。1.2 CCK8检测结果证实TNFAIP8表达下调可抑制AML耐药细胞的增殖能力。1.3流式细胞术检测结果表明,TNFAIP8表达下调可增加化疗药物诱导的AML耐药细胞凋亡率。1.4 CCK8检测结果证实TNFAIP8表达下调可增加AML耐药细胞的化疗药物敏感性。2.TNFAIP8上调对AML细胞生物学行为的影响2.1利用人TNFAIP8过表达慢病毒或对照慢病毒感染TNFAIP8表达水平相对较低的AML敏感细胞株,Real-Time RT PCR和Western Blot验证TNFAIP8表达水平上调。2.2 CCK8检测结果显示TNFAIP8表达上调可促进AML细胞增殖。2.3流式细胞术检测结果显示TNFAIP8表达上调可降低化疗药物诱导的AML细胞凋亡率。2.4 CCK8检测结果显示TNFAIP8表达上调可降低AML细胞的化疗药物敏感性。3.TNFAIP8通过增加ERK信号通路活化水平发挥促白血病效应3.1转录组测序显示,与对照组相比较,TNFAIP8下调组细胞中存在1494个差异性表达基因。GO分析显示下调TNFAIP8表达后细胞的转录组改变涉及蛋白结合、细胞代谢、细胞增殖、信号转导及凋亡调控等生物学过程,pathway分析表明转录组改变主要涉及MAPK通路、代谢相关通路、肿瘤相关通路、凋亡相关通路等。3.2 TNFAIP8表达上调后ERK1/2磷酸化水平增加,TNFAIP8表达减少后ERK1/2磷酸化水平降低,表明TNFAIP8对ERK信号通路活化具有促进作用。3.3 CCK8结果显示ERK1/2抑制剂能够减弱TNFAIP8对细胞增殖的促进作用,流式细胞术结果显示ERK1/2抑制剂可以有效减弱TNFAIP8的凋亡抑制作用,表明TNFAIP8通过促进ERK通路活化发挥促进AML细胞增殖和抑制AML细胞凋亡的作用。4.TNFAIP8通过Rac1影响ERK通路活化水平4.1免疫共沉淀结果表明293T细胞及AML细胞中存在TNFAIP8与Rac1的结合。4.2 Rac 1活化检测结果显示AML细胞中过表达TNFAIP8后Rac 1-GTP增多,而下调TNFAIP8表达后Rac1-GTP减少,证实TNFAIP8能够促进Rac1的活化。4.3 Rac1抑制剂能够减弱TNFAIP8对ERK1/2磷酸化的促进作用,表明TNFAIP8通过激活Rac1促进ERK通路磷酸化。5.体内研究TNFAIP8在AML小鼠模型中的作用5.1建模过程:尾静脉注射小鼠AML细胞株C1498两周后,小鼠逐渐出现毛发稀疏凌乱、精神萎靡、食欲不振等现象,提示小鼠发病。尾静脉注射后第24天对小鼠实施安乐死,解剖动物,进行模型鉴定,并评估两组小鼠AML细胞浸润程度。与对照组AML小鼠相比较,TNFAIP8下调组小鼠肝脾肿大情况减轻,外周血、骨髓、脾脏和肝脏中AML细胞比例降低,骨髓、肝脏及脾脏组织中白血病细胞浸润程度减轻。5.2与对照组AML小鼠相比较,TNFAIP8下调组AML小鼠生存期明显延长。5.3免疫组化结果显示,与对照组AML小鼠相比较,TNFAIP8下调组AML小鼠骨髓局部ERK磷酸化水平降低,进一步证实TNFAIP8通过促进ERK通路活化发挥促进AML细胞增殖作用。研究结论第一部分1.与对照组相比,TNFAIP8在AML复发难治患者及AML耐药细胞株中表达水平明显升高,提示TNFAIP8可能参与AML耐药过程。2.ELF1通过结合TNFAIP8基因启动子区-1154～-1142bp位点促进TNFAIP8基因的转录。3.ELF1在AML患者及AML耐药细胞株中高表达,且ELF1与TNFAIP8表达水平呈正相关,提示ELF1介导TNFAIP8在AML中的表达异常。第二部分1.上调AML细胞中TNFAIP8的表达水平,可促进细胞增殖、抑制细胞凋亡并诱导化疗耐药。2.TNFAIP8可通过结合、激活Rac1促进ERK信号通路活化,减少化疗药物诱导的细胞凋亡,从而促进AML耐药。3.下调TNFAIP8表达可减缓AML发生发展,TNFAIP8有望成为AML治疗的新靶点。