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肺炎克雷伯菌是一种机会性病原体,其栖息于正常的人类微生物群并且主要引起医院获得性感染。特别是碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)分离株的出现导致住院期,死亡率和发病率的增加。碳青霉烯类抗生素作为抵抗产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)的最后一道防线已经失守,现如今耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌不断涌现,特别是主要通过质粒快速传播的CRKP已经成为全世界关注的重要公共卫生问题。替加环素(Tigecycline,TGC)作为新一类甘氨酰四环素类抗生素,具有超广谱的抗菌活性,被目标性地用于多重耐药(MDR)、泛耐药(XDR)菌感染的治疗,也是目前我国治疗CRKP最重要的抗生素。然而令人担忧的是,迄今为止临床上不断出现对TGC耐药的菌株。替加环素耐药肺炎克雷伯菌(TRKP)的出现,将可能使CRKP感染患者陷入非常危险的境地。因此,本研究通过两部分内容,首先探讨我院CRKP的流行情况及耐药特征,再深入探索CRKP菌株耐TGC的新耐药机制,以助于为临床治疗CRKP及TRKP提供重要的参考依据,此外对TGC耐药机制的研究有助于为今后防治TRKP和开发新的药物靶点提供重要依据。第一部分,主要进行CRKP菌株的特征分析,包括CRKP的药敏情况,分子流行特点,耐药基因携带特征,为进一步指导临床用药提供数据证据。我们的细菌库中已经收集了上千株肺炎克雷伯菌,选取菌株库中备注碳青霉烯类抗生素耐药的菌株172株,经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)重新进行菌株鉴定,确定166株CRKP为我们的研究对象。对于入选菌株,我们用微量肉汤稀释法进行TGC最低抑菌浓度(MIC)的测定;选用用多位点序列分析(MLST)进行菌株ST分型及构建系统进化树;利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对儿科重症监护室(NICU)爆发流行的CRKP菌株进行同源性分析;最后,通过荧光定量PCR检测CRKP菌株的耐药基因携带情况。结果显示:我院CRKP阳性率为15.74%(166/1055),166株CRKP均为MDR菌株,对阿米卡星的耐药率最低41.60%,妥布霉素耐药率61.60%,米诺环素64.00%,庆大霉素68.80%,复方新诺明69.20%,头孢哌酮/舒巴坦69.60%,其他常见抗生素耐药率>90.00%,亚胺培南耐药率100.00%;耐药基因检测结果显示KPC-2基因阳性率75.90%(126/166),CTX-M9基因阳性率68.07%(113/166),CTX-M1阳性率7.83%(13/166),OmpK35缺失率4.82%(8/166),OmpK36缺失率93.98%(156/166),OmpK37缺失率5.42%(9/166),未检测到IPM-4、NDM-1和OXA-48基因。微量肉汤稀释法结果显示TGC MIC主要集中在0.25μg/mL及0.5μg/mL,合占73.5%,未发现对TGC耐药的菌株(FDA标准:耐药,MIC≥8μg/mL)。MLST分型分析,共得到24个ST型,我院主要ST型为ST11,占80.12%(133/166);对儿科ICU15株疑似院内感染爆发的菌株进行同源性分析显示,爆发感染菌株为ST37和新型ST006两个克隆株,PFGE显示对应为A类菌株和C类菌株,同源性均大于90.00%。本研究结果表明:我院CRKP流行情况严峻,高于全国的平均耐药水平(15.74%vs 9.0%,2017年),耐药机制主要为产KPC-2酶,未检测到TGC耐药菌株,TGC仍是我院治疗CRKP的有效药物;ST型主要为ST11型,与我国流行菌株ST分型一致。第二部分,主要通过对体外筛选出的TGC耐药CRKP进行转录组测序,生物信息分析,对差异表达的基因进行敲除及回补,来研究TGC新的耐药机制。研究方法:随机挑选3株CRKP菌株(KPN222,简称A菌;KPN114,简称B菌;KPN315,简称C菌)体外筛选TGC耐药突变株,并对耐药突变株及原代菌株进行转录组测序分析,寻找差异表达基因;用qPCR进行差异表达基因的验证;同时利用qPCR检测TGC耐药的其它相关基因;使用自杀质粒pKO3-Km构建菌株cusS-cusR双组分系统cusR基因缺失株,使用pGEM-T-easy质粒构建cusR基因回补株,检测基因编辑前后菌株TGC MIC变化;最后,联合外排泵抑制剂和TGC对TRKP进行体外抑菌效果检测。结果显示:1)通过体外筛选,获得3组(9株)肺炎克雷伯菌,A组:A1,A2,A3,B组:B1,B2,B3;C组:C1,C2,C3。A1,B1,C1为原代菌株,MIC为0.5μg/mL;A2,B2,C2为诱导耐药株,MIC为16μg/mL;A3,B3,C3也为耐药突变株,MIC为32μg/mL。A2,B2,C2,A3,B3和C3菌株,仅对氨基糖苷类,多粘菌素敏感,对其他常见抗生素均显示耐药。2)转录组测序及qPCR验证结果显示,acrAB-tolC外排泵系统在A,B,C组中均有不同程度的升高,但在B组中明显升高(P<0.01);cusS-cusR双组分金属抗性系统在C组中显著升高(P<0.01)。3)肺炎克雷伯菌耐TGC其它相关基因检测显示:ramR调节基因并未检测到突变,texT,Tet(A),soxS,oqxA,oqxB,acrE,acrF,oprD并未有高表达。4)成功构建C3菌株cusR基因敲除株△cusR及基因回补株C-cusR,TGC MIC检测显示MIC分别为4μg/mL和32μg/mL。5)外排泵抑制剂联合TGC检测显示PAβN(苯丙氨酸精氨酸β-萘酰胺)抑制效果显著,NMP(1-甲基-2-吡咯烷酮)及CCCP(羰基-氰-间-氯苯腙)抑制效果不显著。研究表明:不同的菌株间展示了不同的抗生素耐药机制,对于不同的菌株虽然耐药表型相近,但耐药机制却有不同,cusS-cusR双组分系统,作为金属抗性系统(抗铜和银),本研究首次报道了其参与CRKP耐TGC的耐药机制;acrAB-tolC外排泵系统作为多种抗生素的外排泵,它的高表达共同参与了CRKP耐替加环素的耐药机制。