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研究背景和目的治疗性重组蛋白的生产是生物制药中重要的一部分,而重组糖蛋白用于治疗许多疾病。通常情况下,哺乳动物表达系统是生物制药的首选体系。中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是最常用的哺乳动物细胞系,用其作为宿主,能产生接近人源糖蛋白糖基化的治疗性重组糖蛋白。人源细胞和CHO细胞糖基化最大的不同就是CHO细胞有两个糖基化酶,α-1,3-半乳糖转移酶(α-1,3-Galactosyltransferase,GGTA1)和胞苷酸N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH),而这两个酶在人体中已经缺失。在用CHO细胞生产治疗性糖蛋白时,GGTA1产生的α-1,3-半乳糖(α-1,3-galactose,α-gal)和CMAH产生的N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)会引起人体的免疫反应。本研究应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对CHO细胞进行遗传改造,构建了CMAH和GGTA1基因突变的CHO细胞株,希望改进治疗性重组糖蛋白的治疗安全性。方法1.生物信息学分析:在NCBI上查找中国仓鼠的CMAH和GGTA1基因序列,确定CMAH的CDS8和GGTA1的CDS9为目标序列,选择在线软件ZIFIT的CRISPR/Cas Nucleases,设计出CMAH和GGTA1的sg RNA。根据sg RNA序列位置设计Reporter序列。2.构建载体:将合成的CMAH-sg RNA和GGTA1-sg RNA分别和p GL3-U6质粒进行酶切连接,CMAH-Reporter和GGTA1-Reporter分别和pm Cherry-EGFP质粒进行酶切连接,然后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,提取质粒DNA,酶切后进行琼脂糖电泳鉴定。3.细胞转染:p GL3-U6-CMAH-sg RNA、pm Cherry-EGFP-CMAH-Reporter、Cas9和p GL3-U6-GGTA1-sg RNA、pm Cherry-EGFP-GGTA1-Reporter、Cas9用lip3000分别共转染HEK293T细胞,验证sg RNA的切割效率。选择切割效率较高的p GL3-U6-CMAH-sg RNA转染目的细胞CHO-S。再选择切割效率较高的p GL3-U6-GGTA1-sg RNA转染CMAH基因突变的CHO-S细胞。4.单细胞克隆筛选:通过流式细胞分选仪分选得到6株CHO-S单克隆细胞,选取CMAH基因突变的CHO-S单克隆细胞进一步突变GGTA1基因,经流式分选获得6株CHO-S单克隆细胞,并扩大培养。5.突变细胞株基因测序分析:在靶序列两端设计PCR引物,提取CHO-S单克隆细胞基因组DNA,PCR扩增后进行sanger测序。6.突变细胞株m RNA表达检测:提取目的细胞RNA并反转录成c DNA,设计CMAH和GGTA1基因的Q-PCR引物,检测其基因m RNA的表达量。7.目的基因表达:将含人促红细胞生长素(Erythropoietin,EPO)的载体p IRES-neo-EPO转染到CHO细胞突变株,western blot检测EPO的表达能力。结果1.应用CRISPR/Cas9技术成功构建了CMAH基因的切割载体p GL3-U6-CMAH-sg RNA和报告载体pm Cherry-EGFP-CMAH-Reporter。2.应用CRISPR/Cas9技术成功构建了GGTA1基因的切割载体p GL3-U6-GGTA1-sg RNA和报告载体pm Cherry-EGFP-GGTA1-Reporter。3.通过流式分选技术获得CMAH和GGTA1基因突变的单克隆CHO-S细胞。4.突变株细胞1-5均在CMAH基因99546bp位置缺失一个碱基C,在GGTA1基因68384-68385 bp之间插入一个碱基T。5.与野生型CHO-S细胞相比,突变株细胞1-5的CMAH和GGTA1基因m RNA的表达量明显降低。6.与野生型CHO-S细胞相比,突变株细胞1-5具有更强的增殖能力,且能够表达EPO蛋白。结论1.应用CRISPR/Cas9技术成功构建了CMAH和GGTA1基因突变的CHO-S细胞亚系1-5。2.突变株细胞1-5在增殖方面与野生型CHO-S存在异质性。3.突变株细胞1-5能够表达目的糖蛋白。