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目的：逆转录病毒介导HBx基因转移至人肝细胞L02,构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的L02细胞,为研究HBx蛋白与肝癌生物学行为的关系提供细胞模型。观察HBx蛋白对L02细胞增殖、细胞周期的影响,研究联合营养缺乏处理及HBx蛋白对L02细胞的影响,从而为进一步探讨HBx促进L02细胞凋亡可能的分子机制,研究HBx蛋白在肝癌形成过程中的作用奠定基础。
方法：PCR法扩增HBx基因,HBx基因和逆转录病毒质粒pSEB-Flag经SaslⅠ和BglⅡ双酶切后,连接得到重组质粒pSEB-Flag-HBX；转染HEK293细胞,包装产生逆转录病毒；病毒感染L02细胞,稻瘟菌素(Blasticidin)筛选；RT-PCR和Western blot检测HBx蛋白的稳定表达。MTT法检测HBx蛋白对L02细胞增殖的影响；流式细胞术检测HBx蛋白对L02细胞周期的影响。无血清培养基处理L02-HBx细胞后,MTT法检测HBx蛋白对L02细胞增殖的影响；流式细胞术检测HBx蛋白对L02细胞周期的影响；Hoechst33258染色检测HBx蛋白对L02细胞凋亡的影响。1
结果：携带HBx全长基因的pAd-track-HBx质粒经PCR得到HBx全长基因,克隆入逆转录病毒质粒pSEB-Flag,得到重组逆转录病毒质粒pSEB-Flag-HBx,经SalⅠ、BglⅡ双酶切和PCR鉴定和测序,1％琼脂糖凝胶电泳大约500bp处有条带,显示HBx基因成功克隆至质粒；HEK293细胞包装产生逆转录病毒,感染L02细胞,Blasticidin筛选,得到抗性细胞,逆转录病毒DNA成功整合至L02细胞基因组；RT-PCR检测到L02-HBx细胞中HBx mRNA的稳定表达,Western blot检测到L02-HBx细胞中HBx蛋白的稳定表达。MTT检测到L02-HBx细胞与L02-Rv细胞增殖无明显差异；流式细胞术检测到L02-HBx细胞与L02-Rv细胞周期无明显差异。无血清培养基处理细胞后,MTT法检测到L02-HBx细胞与L02-Rv细胞增殖无明显差异；流式细胞术检测到L02-HBx细胞发生G1期阻滞更加明明显；Hoechst33258染色检测到L02-HBx细胞比L02-Rv细胞凋亡更加明显。
结论：1.成功的构建稳定表达HBx蛋白的L02-HBx细胞,为进一步探讨HBx在肝癌发生发展中的作用提供了理想的实验模型。2.HBx蛋白对L02细胞增殖无明显影响。3.HBx蛋白对L02细胞周期无明显影响。4.联合营养缺乏处理和HBx蛋白对L02细胞增殖无明显影响。5.HBx蛋白可加强营养缺乏引起的细胞G1期阻滞。6.联合营养缺乏和HBx蛋白可促讲细胞凋亡。