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目的:急性肺损伤(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由严重感染、创伤、休克、中毒、吸入有害气体、急性胰腺炎、病理产科等导致的急性、进行性呼吸衰竭。其中血管内皮细胞(endothelial cell,EC)屏障功能受损造成血管高通透性,富含蛋白液体血管外渗造成肺间质水肿是导致ALI和ARDS的主要原因。研究表明,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)能诱导机体免疫系统产生大量的致炎因子,氧自由基等,严重损伤周身器官,最终导致严重的ARDS及败血症,死亡率高,目前LPS已被广泛应用在ALI的动物感染模型中。富氢水(hydrogen rich saline,HRS)是很好的抗氧化物,其具有抗炎、抗氧化应激以及抗凋亡的特性,已有报道显示不同剂量的氢气饱和生理盐水可以通过细胞炎症反应、氧化应激及凋亡方面减轻吸入性损伤大鼠的急性肺损伤,但其机制不详。细胞自噬是真核细胞自我消化以获得存活机会的一种高度保守生物学过程。自噬的关键调节蛋白雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通过抑制转录因子EB(TFEB)进入细胞核发挥作用。mTORC1的激活能够通过磷酸化TFEB而抑制其发生核转位是负性调控自噬发生的关键分子。有研究表明,HRS可以促进自噬减少自噬体堆积在ALI模型中发挥保护作用,但是机制尚不清楚。本研究通过建立LPS诱导的大鼠急性肺损伤模型,利用HRS进行预处理,观察其对ALI的保护作用及对自噬相关蛋白的影响;并通过体内和体外实验探讨HRS的治疗作用是否与mTORC1/TFEB信号通路有关,为临床急性肺损伤的机制及药物的靶向治疗提供理论依据。方法:第一部分:体内实验,将SD大鼠分为3组:(1)LPS诱导的大鼠肺损伤模型组(LPS组);(2)富氢水预处理组(HRS+LPS组),(3)对照组(control组)。首先制作各组大鼠肺脏病理切片,观察各组大鼠肺脏的病理变化;TUNEL法检测各组肺脏细胞的凋亡水平;应用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测肺泡灌洗液中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10,血管内皮功能相关因子ET-1、VEGF、SDF-1α和e NOS的表达量的变化;Western Blot检测大鼠肺脏凋亡相关蛋白bcl2、Bax以及Caspase3蛋白的表达变化。体外实验:HPMEC传代培养分为对照组(control组)、LPS组、HRS+LPS组。CCK8检测细胞活性;流式细胞检测细胞凋亡;ELISA检测上清液中的炎性因子;Western Blot检测血管内皮功能相关因子ET-1、VEGF、SDF-1α和e NOS的表达量的变化。第二部分:体内实验,在实验一的基础上增加自噬抑制剂组:LPS+HRS+CQ组:大鼠于建模前每天腹腔注射富氢水5mg/kg,在注射LPS前30min,腹腔注射氯奎;LPS+HRS+3MA组:大鼠于建模前每天腹腔注射富氢水5mg/kg,在注射LPS前30min,腹腔注射3MA;HE染色观察病理组织学变化;Western Blot以及逆转录定量PCR(qRT-PCR)检测各组肺脏自噬相关蛋白Beclin1、LC3-II和P62的表达变化;体外实验:将HPMEC细胞分为Control组、LPS组、HRS+LPS处理组、自噬抑制剂组(HRS+LPS+CQ组)、自噬抑制剂组(HRS+LPS+3MA组)。CCK8检测各组细胞活性;用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况;ELISA检测上清液中的炎性因子;Western Blot和qRT-PCR检测各组细胞中自噬相关蛋白Beclin1、LC3-II和P62的表达变化。第三部分:Western Blot检测实验一各组肺脏mTORC1/TFEB信号通路相关蛋白p-mTOR、p-S6、mTOR和S6表达量的变化;免疫组化检测TFEB蛋白表达;体外实验:HPMEC细胞分组:Control组、LPS组、HRS+LPS处理组、LPS+HRS+OSI-027组:加入LSP前1h加入10ul/ml HRS溶液,LPS诱导后加入mTOR抑制剂OSI-02710nmol/l;HRS+LPS+MHY1485组:加入LSP前1h加入10ul/ml HRS溶液,LPS诱导后加入mTOR激动剂MHY1485进行处理;CCK8检测各组细胞活性;用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况;ELISA检测各组HPMEC细胞上清液中炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的变化;用Western Blot检测各组细胞中自噬相关蛋白mTOR、p-mTOR、Beclin1、LC3-II和P6的表达量变化;免疫荧光检测TFEB蛋白表达。结果:第一部分:体内实验:HE染色显示,LPS组大鼠肺组织中可见肺支气管壁增厚、肺水肿、炎性细胞浸润;HRS组肺泡损伤、炎性渗出程度以及间质细胞增生程度减轻;与control组相比,LPS组SD大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α含量升高,IL-10含量降低(P<0.05);与LPS组相比,HRS组IL-1β、IL-6、TNF-α含量降低,IL-10含量升高,两组间比较具有显著差异(P<0.05)。TUNEL观察肺脏凋亡,结果与control组相比,LPS组凋亡率升高,HRS组凋亡率下降,组间比较具有统计学差异(P<0.05)。血管功能检测结果显示,与对照组相比,LPS组ET-1、VEGF、SDF-1α含量升高,e NOS含量降低;与模型组相比ET-1、VEGF、SDF-1α含量降低,e NOS含量升高,组间比较具有统计学差异(P<0.05)。体外实验:与control组相比,LPS组细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α含量升高,细胞活性降低,IL-10含量降低,两组比较具有统计学差异(P<0.05);与LPS组相比,HRS组细胞活性升高,凋亡率下降,IL-1β、IL-6、TNF-α含量降低,IL-10含量升高,两组间比较具有显著差异(P<0.05)。第二部分:HRS+LPS组,肺脏水肿减轻,炎性细胞减少;HRS+LPS+CQ组和HRS+LPS+3MA组,肺水肿严重,炎性细胞浸润。与对照组相比较,LPS组中Beclin1、LC3-II蛋白表达升高,P62蛋白表达降低,组间比较具有统计学差异(P<0.05);与LPS组相比,LPS+HRS组自噬相关蛋白Beclin1和LC3-II的表达量高于LPS组,P62蛋白的表达量低于LPS组(P<0.05)。与HRS+LPS比较:LPS+HRS+3MA组LC3-II表达降低(p<0.05),P62的表达增加(p<0.05),Beclin1表达降低但不显著;LPS+HRS+CQ组LC3-II和P62明显升高(p<0.05),Beclin1变化不显著。体外实验:与LPS组相比,HRS可提高HPMEC细胞活性;而加入自噬抑制剂后,细胞的活性有所降低(P<0.05)。ELISA检测细胞上清液中ET-1、VEGF、SDF-1α、e NOS含量,结果与LPS组相比,HRS组IL-1β、IL-6、TNF-α含量降低,IL-10含量升高,两组间比较具有显著差异(P<0.05);与HRS组相比,LPS+HRS+CQ组和LPS+HRS+3MA组IL-1β、IL-6、TNF-α含量升高,IL-10含量降低,组间比较具有统计学差异(P<0.05)。流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,结果加入HRS后,可以抑制由LPS导致的细胞凋亡,而加入自噬抑制剂后,细胞凋亡率有所升高,两组间比较具有统计学差异(P<0.05)。与对照组相比较,LPS组中Beclin1、LC3-II蛋白表达升高,P62蛋白表达降低,组间比较具有统计学差异(P<0.05);与LPS组相比,LPS+HRS组自噬相关蛋白Beclin1和LC3-II的表达量高于LPS组,P62蛋白的表达量低于LPS组(P<0.05)。与HRS+LPS比较:LPS+HRS+3MA组LC3-II表达降低(p<0.05),P62的表达增加(p<0.05),Beclin1表达降低但不显著;LPS+HRS+CQ组LC3-II和P62明显升高(p<0.05),Beclin1变化不显著。第三部分:体内实验:Western Blot检测mTORC1/TFEB信号通路相关蛋白磷酸化水平。与LPS组相比,HRS组p-mTOR和p-S6蛋白的表达量明显下降(P<0.05)。免疫组化检测TFEB表达,LPS组中细胞浆中有大量TFEB表达,而加入HRS后,TFEB入细胞核,核表达显著升高。体外实验:HRS可以提高细胞活性,加入mTORC1激动剂后细胞活性降低,组间比较具有统计学差异(P<0.05);与HRS组相比,加入mTORC1抑制剂时,细胞活性显著升高(P<0.05)。流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,结果与HRS相比,HRS+LPS+MHY1485组凋亡率升高,LPS+HRS+OSI-027组凋亡率显著降低,组间比较具有统计学差异(P<0.05);炎性因子检测结果显示与HRS组相比,HRS+LPS+MHY1485组TNF-α、IL-6和IL-1β的表达量明显升高,IL-10的表达量明显下降(P<0.05),HRS+OSI-027组性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达量明显下降),IL-10的表达量明显升高(P<0.05),组间比较具有统计学差异(P<0.05)。Western Blot检测HPMEC中mTOR、p-mTOR、LC3-II、Beclin1及P62蛋白的表达,结果与HRS组相比,HRS+LPS+MHY1485组p-mTOR、P62表达升高,LC3-II、Beclin1表达降低;HRS+LPS+OSI-027组p-mTOR、P62表达降低,LC3-II、Beclin1表达升高,组间比较具有统计学差异(P<0.05)。免疫荧光检测TFEB表达,结果与LPS组相比,HRS组TFEB主要在细胞核中表达;与HRS组相比,HRS+LPS+MHY1485组细胞核中TFEB表达降低,HRS+LPS+OSI-027组表达升高,组间比较具有统计学差异(P<0.05)。结论:1.富氢水改善内毒素诱导的急性肺损伤大鼠血管内皮功能;2.富氢水激活自噬,对内毒素诱导的急性肺损伤大鼠发挥保护作用;3.富氢水能通过mTORC1/TFEB信号通路激活自噬,改善急性肺损伤大鼠血管内皮功能,减轻肺损伤。