牛支原体(M.bovis)是感染牛的一种重要致病性病原体,该病原在1961年从美国牛乳腺炎病例中首次分离,1976年美国首次报道牛支原体引起的肺炎。该病原除引起牛肺炎外,还可引发关节炎、乳腺炎、角膜结膜炎等疾病,这些与M.bovis相关的疾病被简称为MbAD。近几年MbAD已经在世界范围内广泛传播,在欧洲和北美更是大肆流行,给世界养牛业造成了很严重的经济损失。我国于2008年首次报道了M.bovis肺炎,继此在不同省份相继暴发了以犊牛呼吸道感染为主要临床特征的“传染性牛支原体肺炎”疫情。本研究在M.bovis湖北株的全基因组序列的测定完成的基础上,通过蛋白质组学技术初步分离鉴定M.bovis免疫相关分子,通过分子生物学方法初步验证其免疫功能,打破新型诊断试剂和疫苗研制的瓶颈,为M.bovis防治提供新的依据。首先,建立了分离M.bovis全菌蛋白的2-DE技术平台。通过对M.bovis全菌蛋白样品制备的方法,固相干胶条pH梯度上样量及染色等影响双向电泳图谱质量的关键因素与环节进行改进,成功提取了M.bovis的全细菌蛋白,并对M.bovis蛋白质组成分进行2-DE分离,建立了适合分离M.bovis蛋白的双向凝胶电泳技术方案,得到了分辨率较高和重复性较好的电泳图谱,为M.bovis蛋白质组学研究奠定了良好的基础。其次,成功地用菌体培养物攻毒制备的牛支原体阳性血清对M.bovis的全细菌蛋白进行了免疫蛋白质组学研究。利用M.bovis全细菌蛋白的2-D电泳凝胶Western blot结果在相应凝胶上找出具有免疫原性的蛋白质点,通过质谱分析并进行Mascot检索,得到了免疫相关蛋白的氨基酸序列,又通过序列比对从M.bovis湖北株基因库中获得免疫原性蛋白的编码序列。该方法的建立使得M.bovis免疫机制研究不再盲目,并为高通量、大规模地表达、纯化M.bovis免疫相关蛋白及其进一步的功能研究奠定了技术基础。本实验采用建立的方法筛选出了50个免疫原性蛋白,并在20个送测样品的质谱结果中获得了19个肽质量指纹图谱,其中12个蛋白在M.bovis湖北株基因库中找到了相应编码序列,这些蛋白经功能分析多数为酶类。最后,本实验针对优选出的氨基酸序列符合率最高的P32蛋白基因进行了基因的克隆,扩增的序列与参考序列100%同源。并顺利进行了表达和纯化,纯化后的重组蛋白用M.bovis湖北分离株培养物气管灌注攻毒后获得的阳性血清进行Western blot分析,结果为阳性,初步表明这个蛋白具有免疫性,用间接ELISA法对P32重组蛋白进行免疫学交叉反应实验,发现P32重组蛋白与自然感染和人工感染M.bovis阳性血清均能发生特异性反应,而与牛传染性胸膜肺炎(CBPP)及其他常见病原的阳性血清没有交叉反应,有希望用作鉴别诊断抗原。