【研究背景】骨肉瘤是儿童和青少年最常见的骨组织恶性肿瘤之一,恶性程度高,侵袭性强,易早期发生血行转移。虽然手术和新辅助化疗的应用大大提高了患者的生存率,但仍有近一半患者死于转移。肿瘤的侵袭与转移是恶性肿瘤的主要生物学特征,也是恶性肿瘤患者的主要死因。所以如何有效预防和治疗转移,对改善骨肉瘤患者的预后至关重要。槲皮素（Quercetin）是一类天然类黄酮物质,广泛存在于蔬菜、水果和植物中,具有多种生物学功能。大量研究报道槲皮素具有抗炎、抗过敏、扩张冠脉、抗血小板聚集、抗氧化、抗癌防癌、调节免疫功能等作用。在欧美等国家,槲皮素已经被推荐为天然的潜力抗癌药物。新近研究发现槲皮素能够降低乳腺癌、鼻咽癌、卵巢癌、结肠癌等多种肿瘤的发生。然而,槲皮素在骨肉瘤中的研究鲜见报道。【研究目的】通过体内外实验观察槲皮素对人骨肉瘤细胞侵袭转移能力的抑制作用和相关分子机制,为更好地理解槲皮素的潜在抗骨肉瘤作用提供理论基础。【研究方法】1.槲皮素对骨肉瘤细胞活力、周期、凋亡的影响（1）人骨肉瘤细胞株HOS和人骨肉瘤细胞株MG63,复苏传代培养。向24孔板中加入5×10⁴个细胞/孔,采用不同浓度组槲皮素（0、25、50、100μM）作用12h和24h后,再向每孔细胞中加入40μl CCK-8试剂,37°C生化培养箱继续孵育2h,然后在450nm波长处测定细胞吸光度值来检测细胞活力。（2）向24孔板中加入5×10⁴个细胞/孔,采用不同浓度组槲皮素（0、25、50、100μM）作用24h后,胰酶消化细胞,根据细胞周期试剂盒说明书测定人骨肉瘤细胞的细胞周期变化。（3）用FITC/PI试剂盒测定细胞的凋亡情况。向24孔板中加入5×10⁴个细胞/孔,采用不同浓度组槲皮素（0、25、50、100μM）作用24h后,根据FITC/PI凋亡试剂盒说明书测定人骨肉瘤细胞的细胞凋亡情况。2.槲皮素对骨肉瘤细胞侵袭和转移能力的影响（1）将50μl液化的Matrigel基质胶均匀铺于Transwell小室的微孔膜上,于37℃孵育6h,使Matrigel聚合成胶。细胞铺板6小时后,加入不同浓度组的槲皮素（0、25、50、100μM）处理。以不含血清的培养基重悬骨肉瘤细胞,加入5×10⁴个细胞/孔在transwell上室,下室加入含10%血清培养基,作用24h,固定细胞,结晶紫染色后用棉签轻轻拭去基质胶和上室细胞,200×光镜下观察5个视野并计数穿过人工基底膜的细胞数,计算其平均值。（2）收集对数生长期的骨肉瘤细胞,接种于24孔板中（5×10⁴个细胞/孔）。细胞培养24h,长满单层后,用10μl枪头比着直尺,尽量垂直于背后的横线划痕。用PBS洗去划痕后漂浮的细胞（以此作为0 h）,加入不同浓度组槲皮素（0、25、50、100μM）的无血清培养基继续培养,检测细胞的迁移率。在0h,12h和24h时于光学显微镜下观察并拍照记录。3.槲皮素对骨肉瘤细胞侵袭转移相关基因mRNA和蛋白变化的影响（1）实时荧光定量PCR法测定HIF-1α,VEGF,MMP2和MMP9 mRNA表达情况:向6孔板中加入2×10⁵个细胞/孔,加入不同浓度组槲皮素（0、25、50、100μM）培养24 h。培养到时间点的细胞弃培养基,Trizol法提取骨肉瘤细胞RNA,逆转录反应根据TAKARA公司RT试剂盒进行,荧光定量PCR反应是根据TAKARA公司荧光定量PCR试剂盒说明书建立。反应产物的特异性通过溶解曲线为单峰来判断。（2）用蛋白免疫印迹实验（Western blotting）测定HIF-1α,VEGF,MMP2和MMP9蛋白表达情况:向6孔板中加入2×10⁵个细胞/孔,加入不同浓度组槲皮素（0、25、50、100μM）培养24h。培养到时间点的细胞弃培养基,将含蛋白酶抑制剂的RIPA加入骨肉瘤细胞中,刮取并离心细胞,收集细胞裂解上清液。取40μg蛋白上样,采用SDS-PAGE法电泳,分离后的蛋白转移到PVDF膜,用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭1h,4℃孵育HIF-1α,VEGF,MMP2和MMP9的多克隆抗体过夜,室温孵育二抗1h,加入ECL曝光。用ImageJ图像分析软件分析免疫印迹灰度值。4.裸鼠成瘤动物实验（1）实验分组:（1）空白对照组:生理盐水;（2）阳性对照组:顺铂组,2mg/kg;（3）槲皮素组:a.低浓度组,25mg/kg;b.中浓度组:50mg/kg;c.高浓度组:100mg/kg。（2）细胞准备和药物准备:构建重组质粒p Lenti-CMV-mCherry-linker-Luc-PGK转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,感染人骨肉瘤细胞HOS,荧光鉴定感染率100%,建立稳定细胞株。取对数生长期的细胞,胰酶消化离心后,用生理盐水重悬,配制成5×10⁸个/ml单细胞悬液。（3）模型建立及给药方案:30只裸鼠随机分为五组。在无菌条件下于裸鼠尾静脉接种,每只裸鼠接种0.2ml（即1×10⁸个细胞）单细胞悬液。3天后,腹腔注射25,50或100 mg/kg槲皮素。每日两次,为期四周。阳性对照组顺铂剂量为2mg/kg。阴性对照组用生理盐水注射。四周后裸鼠采用水合氯醛麻醉,腹腔注射D-荧光素30秒后颈椎脱臼处死,手术去除前胸壁,马上用活体小动物成像系统和活体图像软件检测肺转移灶。所有的上述程序和化验方法经广州医科大学动物卫生管理和使用委员会批准。计算抑制率:[（C-T）/C]×100%（公式1）,治疗组的平均荧光为T,C为阴性对照组的平均荧光。【实验结果】1、槲皮素对人骨肉瘤细胞活力的影响:0、25、50、100μM的槲皮素作用于人骨肉瘤细胞株HOS和人骨肉瘤细胞株MG63 12h和24h,CCK-8法检测细胞活性。结果显示,不同浓度的槲皮素对人骨肉瘤细胞HOS和MG63活性无明显影响,P>0.05,无统计学意义。根据CCK-8测定槲皮素对人骨肉瘤细胞活力影响的结果,可选取0、25、50、100μM可作为后续实验刺激浓度。2、槲皮素对人骨肉瘤细胞周期的影响:不同浓度槲皮素（0、25、50、100μM）刺激人骨肉瘤细胞株HOS和MG6324h,应用细胞周期检测试剂盒测定细胞周期分布状况。结果显示,不同浓度槲皮素（0、25、50、100μM）对人骨肉瘤细胞株HOS和MG63细胞G₀/G₁、G₂/M和S期无明显影响,其差异没有统计学意义。3、槲皮素对人骨肉瘤细胞凋亡的影响:不同浓度槲皮素（0、25、50、100μM）刺激人骨肉瘤细胞株HOS和MG6324 h,应用Alexa Fluor 488 annexin V/Dead cell凋亡试剂盒测定凋亡情况。与0μM槲皮素对照组比较,槲皮素刺激下人骨肉瘤细胞HOS和MG63未发生明显的早期或者中晚期凋亡。4、槲皮素对人骨肉瘤细胞侵袭能力的影响:采用Transwell侵袭小室实验观察槲皮素作用后人骨肉瘤细胞侵袭通过人工基底膜后的能力。下室加入含不同浓度槲皮素的含血清的培养基,培养24小时。Transwell侵袭实验结果显示,25μM槲皮素组、50μM槲皮素组、100μM槲皮素组平均穿膜HOS细胞数分别为0μM槲皮素组平均穿膜细胞数的（83.98±2.76）%,（38.67±3.52）%和（16.36±2.56）%,差异有统计学意义（P<0.05）,槲皮素处理组穿膜HOS细胞数明显低于0μM槲皮素空白对照组。随着槲皮素浓度增加,抑制HOS细胞侵袭能力增加。25μM槲皮素组、50μM槲皮素组、100μM槲皮素组平均穿膜MG63细胞数分别为0μM槲皮素组平均穿膜细胞数的（87.55±4.98）%,（69.34±5）%和（41.98±4.4）%,差异有统计学意义（P<0.05）,槲皮素处理组穿膜MG63细胞数明显低于0μM槲皮素空白对照组。随着槲皮素浓度增加,抑制MG63细胞侵袭能力增加。我们研究证实了,槲皮素抑制人骨肉瘤细胞的细胞侵袭,呈剂量依赖。5、槲皮素对人骨肉瘤细胞迁移能力的影响:我们采用划痕实验来观察槲皮素对人骨肉瘤细胞的迁移能力的影响。结果发现,不同浓度的槲皮素作用于两种人骨肉瘤细胞。处理12h后,25μM槲皮素组、50μM槲皮素组、100μM槲皮素组与0μM槲皮素组对照组迁移距离的比率分别为:HOS细胞（72.28±22.34）%、（61.49±19.61）%、（49.66±9.33）%;MG63细胞（39.49±5.9）%、（31.15±12.27）%、（20.34±4.25）%,差异有统计学意义（P<0.05）。处理24h后,25μM槲皮素组、50μM槲皮素组、100μM槲皮素组与0μM槲皮素组对照组迁移距离的比率分别为:HOS细胞（59.40%±20.13）%、（42.78±11.34）%、（46.06±11.5）%;MG63细胞（36.39±3.09）%、（28.43±0.7）%、（21.26±7.47）%,差异有统计学意义（P<0.05）。我们研究证实,槲皮素能够抑制人骨肉瘤细胞的细胞迁移,呈剂量时间依赖。6、槲皮素对人骨肉瘤细胞相关基因mRNA和蛋白的影响:不同浓度槲皮素（0、25、50、100μM）刺激人骨肉瘤细胞株HOS 24 h,提取总RNA反转录后进行荧光定量PCR。结果显示,随着槲皮素浓度增加,HIF-1α（0.65±0.05,0.08±0.02,0.04±0.01）;VEGF（0.25±0.09,0.07±0.01,0.01±0.01）;MMP2（0.48±0.06,0.15±0.05,0.14±0.07）;MMP9（0.28±0.08,0.12±0.02,0.08±0.02）的mRNA水平呈现逐渐降低的现象,与0μM槲皮素对照组相比,有统计学意义,P<0.05。蛋白免疫印迹结果所示,0、25、50、100μM槲皮素处理后HIF-1α的灰度值分别为:（0.57±0.08,0.45±0.07,0.42±0.08,0.42±0.01）;VEGF的灰度值分别为（0.51±0.04,0.48±0.09,0.37±0.10,0.25±0.03）;MMP2的灰度值分别为（0.59±0.01,0.54±0.13,0.46±0.07,0.34±0.01）;MMP9的灰度值分别为（1.07±0.06,0.89±0.19,0.75±0.07,0.60±0.16）。随着槲皮素浓度增加,HIF-1α、VEGF、MMP 2、MMP 9的蛋白水平呈现逐渐降低的现象,与0μM槲皮素对照组相比,有统计学意义,P<0.05。槲皮素抑制人骨肉瘤细胞的HIF-1α、VEGF、MMP 2和MMP 9的mRNA和蛋白表达,呈剂量依赖。7、裸鼠成瘤动物实验:为明确槲皮素对骨肉瘤的影响,体内注射稳定转染的HOS细胞入裸鼠尾静脉。术后三天,动物予槲皮素、生理盐水或顺铂治疗等效体积。实验结果表明槲皮素能剂量依赖性显著抑制肺部肿瘤生长。与生理盐水治疗的对照鼠对比,25、50和100 mg/kg槲皮素处理鼠的肺肿瘤荧光表达分别为0.89±0.10,0.71±0.06,0.63±0.05,顺铂治疗组鼠肿瘤为0.63±0.04。根据公式1计算抑瘤率,与生理盐水处理组对比,100 mg/kg槲皮素槲皮素抑制肿瘤37.41%、顺铂治疗抑制肿瘤36.46%。结果表明,槲皮素能抑制骨肉瘤体内肿瘤转移。【实验结论】1、25-100μM槲皮素不影响人骨肉瘤细胞的细胞活性,不影响人骨肉瘤细胞的凋亡和周期改变。2、槲皮素抑制人骨肉瘤细胞的细胞侵袭转移,呈剂量依赖。3、槲皮素抑制人骨肉瘤细胞的HIF-1α、VEGF、MMP2和MMP9的mRNA和蛋白表达,呈剂量依赖。4、裸鼠成瘤动物实验,进一步证实了槲皮素可抑制裸鼠肺内转移瘤生成。